Пцр анализ крови у новорожденного

Диагностика ВИЧ-инфекции у детей, рожденных от ВИЧ-инфицированных матерей, затруднена в связи с тем, что в крови таких детей в течение длительного времени сохраняются материнские АТ к ВИЧ. На сегодняшний день разработаны эффективные методы профилактики вертикальной передачи ВИЧ: антиретровирусная терапия (АРВТ), которая проводится у матери во время беременности и родов и у ребенка в первые недели жизни; акушерские вмешательства, включая плановое кесарево сечение; отказ от грудного вскармливания. Там, где эти методы доступны и применяются, частоту передачи ВИЧ от матери ребенку удается снизить до 1–2%. Поскольку материнские АТ сохраняются в крови новорожденных детей в течение длительного времени, определение АТ позволяет снять диагноз ВИЧ-инфекции детям только в возрасте 15–18 месяцев с последующим подтверждением результата методом ИБ.

Проблема более ранней диагностики ВИЧ-инфекции у новорожденных детей за рубежом была решена несколько лет назад с появлением молекулярно-биологических методов, которые позволяют выявлять фрагменты генома ВИЧ в крови на ранних сроках инфицирования. Было показано, что у большинства инфицированных детей ДНК провируса ВИЧ может быть выявлена к первому месяцу жизни и практически у всех к шестому месяцу.

Показания к применению различных лабораторных исследований и особенности интерпретации результатов. Для ранней диагностики ВИЧ-инфекции у детей, рожденных от ВИЧинфицированных матерей, предпочтительно выявлять ДНК провируса ВИЧ в клетках крови. Не рекомендуется использовать выявление РНК ВИЧ, поскольку профилактическая АРВТ, проводимая во время беременности матери и после рождения ребенку, может существенно снизить репликацию вируса, что приведет к снижению концентрации РНК ВИЧ и повысит вероятность получения ложноотрицательного результата при обследовании ребенка. Для определения ДНК провируса ВИЧ используют методики, основанные на АНК (в подавляющем большинстве случаев – ПЦР).

Обследование ребенка, рожденного от ВИЧ-инфицированной матери, для выявления ДНК провируса ВИЧ желательно проводить в возрасте:

до 48 ч жизни;
1–2 мес;
3–6 мес.

Положительный результат наличия ДНК провируса ВИЧ должен быть подтвержден, для повторного анализа следует использовать дополнительный образец крови, полученный в более поздние сроки по сравнению с предыдущим образцом.

Получение положительных результатов выявления ДНК ВИЧ в двух отдельно взятых образцах крови у ребенка старше одного месяца является лабораторным подтверждением диагноза ВИЧ-инфекции.

Получение двух отрицательных результатов выявления ДНК провируса ВИЧ у ребенка в возрасте старше 4–6 месяцев (при отсутствии грудного вскармливания) свидетельствует против наличия у ребенка ВИЧ-инфекции, однако снятие ребенка с диспансерного учета по поводу интранатального и перинатального контакта по ВИЧ-инфекции может производиться в возрасте старше 1 года при одновременном наличии следующих условий:

два отрицательных результата исследования обнаружения ДНК провируса ВИЧ методом ПЦР, один из которых выполнен в возрасте 4 месяца или старше;
два и более отрицательных результата исследования обнаружения антител к ВИЧ методом ИФА, выполненных в возрасте 12 месяцев или старше;
отсутствие гипогаммаглобулинемии на момент исследования крови на наличие антител к ВИЧ;
отсутствие клинических проявлений ВИЧ-инфекции.

Показания к обследованию для обнаружения ДНК провируса ВИЧ

Ранняя лабораторная диагностика ВИЧ-инфекции у детей, рожденных от ВИЧинфицированных матерей;
разрешение сомнительных результатов иммунного блота;
выявление ВИЧ-инфекции у лиц с подозрением на недавнее инфицирование.

Источник

Полимеразная цепная реакция известна уже 30 лет. Ее широко используют во многих областях, начиная с археологии и заканчивая генетикой.

Именно метод пцр помогает установить отцовство, но наиболее часто его используют для выявления различных инфекционных болезней в организме человека.

Как проводят анализ методом пцр, и что это такое? На эти вопросы мы постараемся детально ответить.

Анализ ПЦР — что это такое?

Полимеразная цепная реакция (ПЦР) – высокоточный метод молекулярно-генетической диагностики, который позволяет выявить у человека различные инфекционные и наследственные заболевания, как в острой и хронической стадии, так и задолго до того, как заболевание может себя проявить.

Метод ПЦР — абсолютно специфичен и выполненный правильно не может дать ложноположительный результат. То есть, если инфекции нет, то анализ никогда не покажет, что она есть. Поэтому сейчас очень часто для утверждения диагноза дополнительно сдают анализ ПЦР, чтобы определить возбудителя и его природу.

Полимеразную цепную реакцию (ПЦР) в 1983 году разработал Кэри Мюллис (США), за что в 1993 году он удостоен Нобелевской премии в области химии.

В чем преимущество данного метода?

Диагностика этим методом позволяет найти возбудителя непосредственно в гене, который содержится в исследуемых материалах. Это самый точный анализ на половые инфекции, скрытые инфекции, различные венерические заболевания.

Отличия ПЦР-диагностики от других методов лабораторного исследования заключаются в следующем:

метод нацелен на выявление самого возбудителя;
диагностика методом ПЦР отличается универсальностью: для обнаружения возбудителей нескольких;
заболеваний достаточно только одного биологического образца больного;
метод обладает высокой чувствительностью и не сопровождается другими перекрестными реакциями.

Кроме этого, преимуществом ПЦР-диагностики является то, что для анализа пригоден любой биологический материал пациента: кровь, выделения из половых органов, моча, сперма.

Какие инфекции позволяет выявить мазок на ПЦР?

В организме может присутствовать большое количество возбудителей инфекций, сюда относятся и «скрытые», которые длительное время никак себя не проявляют.

Анализ мазка на ПЦР позволяет выявить такие инфекции:

гепатит;
уреплазмоз половых органов;
кандидоз (молочница);
хламидиоз половых путей;
папиллома вирусная инфекция;
герпес;
наличие раковых клеток;
микоплазмоз;
бактериальный вагиноз;
инфекционный мононуклеоз;
трихомониаз;
оценить гормональное состояние;
СПИД (ВИЧ).

Исследуемым материалом для ПЦР обычно являются мокрота, слюна, моча, кровь. Перед проведением анализа необходимо тщательно подготовиться к нему, получив предварительную консультацию у врача.

Кровь для ПЦР обычно сдается натощак. Хорошие результаты показывает проведение анализа, когда материал для исследования взят из цервикального канала или уретры. В этом случае лучше всего провести ПЦР-диагностику не позже, чем через сутки после полового акта.

Разновидности ПЦР

ПЦР используется во многих областях для проведения анализов и в научных экспериментах. Существуют разные методики проведения анализа:

ПЦР с обратной транскрипцией (Reverse Transcription PCR, RT-PCR (англ.)) — используется для амплификации, выделения или идентификации известной последовательности из библиотеки РНК.
Инвертированная ПЦР (Inverse PCR (англ.)) — используется в том случае, если известен лишь небольшой участок внутри нужной последовательности. Этот метод особенно полезен, когда нужно определить соседние последовательности после вставки ДНК в геном.
Вложенная ПЦР (Nested PCR (англ.)) — применяется для уменьшения числа побочных продуктов реакции. Используют две пары праймеров и проводят две последовательные реакции.
Асимметричная ПЦР (англ. Asymmetric PCR) — проводится тогда, когда нужно амплифицировать преимущественно одну из цепей исходной ДНК. Используется в некоторых методиках секвенирования и гибридизационного анализа.
Количественная ПЦР (Quantitative PCR, Q-PCR (англ.)) или ПЦР в реальном времени — используется для непосредственного наблюдения за измерением количества конкретного ПЦР продукта в каждом цикле реакции.
Ступенчатая ПЦР (Touchdown PCR (англ.)) — с помощью этого подхода уменьшают влияние неспецифического связывания праймеров.
Групп-специфическая ПЦР (англ. group-specific PCR) — ПЦР для родственных последовательностях внутри одного или между разными видами, используя консервативные праймеры к этим последовательностям.

Если нуклеотидная последовательность матрицы известна частично или неизвестна вовсе, можно использовать вырожденные праймеры, последовательность которых содержит вырожденные позиции, в которых могут располагаться любые основания. Например, последовательность праймера может быть такой: …ATH…, где Н — А, Т или С.

Какие биологические материалы исследуются?

Материалом для ПЦР-исследования, в котором можно выявить чужеродную ДНК бактерии или ДНК или РНК вируса могут служить различные биологические среды и жидкости человека:

Моча. Может использоваться при инфекционном поражении мочеполового тракта у мужчин и мочевыделительных органов у женщин (у мужчин использование в качестве материала мочи заменяет эпителиальный соскоб).
Мокрота. Применяется для диагностики туберкулеза и реже для диагностики респираторных форм хламидиоза и микоплазмоза. Мокроту в количестве 15-20 мл собирают в стерильный (одноразовый) флакон.
Биологические жидкости. Сок простаты, плевральная, спинномозговая, околоплодная, суставная жидкость, бронхоальвеолярный лаваж, слюна забираются по показаниям.
Эпителиальные соскобы со слизистых оболочек. Обычно используются для диагностики заболеваний, передающихся половым путем (ЗППП), таких как гонорея, хламидиоз, микоплазмоз, уреаплазмоз, трихомониаз, гарднереллез, герпетическая и другие инфекции, поражающие слизистые оболочки.
Биоптаты. Чаще всего используют биоптаты желудка и двенадцатиперстной кишки для выявления хеликобактерной инфекции.
Кровь, плазма, сыворотка. Используются для ПЦР анализа вирусов гепатитов B, C, D, G, герпеса, ЦМВ, ВИЧ, исследования генов человека.

Как подготовиться к сдаче анализа?

Достоверность результата ПЦР напрямую зависит от правильности сдачи материала на обследование. Материал не должен быть загрязнен, иначе результат исследования не будет объективен. К наиболее важным рекомендациям перед сдачей анализа ПЦР относятся следующие требования:

Моча сдается утром в стерильный контейнер.
Анализ крови на инфекции необходимо сдавать на голодный желудок в утреннее время.
Не стоит проявлять половую активность за сутки до проведения анализа.

Результат анализа будет готов через 1,5-2 суток после проведения рассматриваемой процедуры. Встречаются такие ситуации, когда результат может быть подготовлен в тот же день.

Расшифровка анализа ПРЦ

Процесс интерпретации представленного исследования отличается своей простотой. Результаты пцр анализа можно получить через 1,5-2х суток после сдачи материала. В некоторых случаях результат готов в первый же день, и вот что они могут означать:

Отрицательный результат показывает, что в диагностируемом материале отсутствует искомый инфекционный возбудитель.
Пцр положительный обозначает, что в организме человека присутствует ДНК или РНК возбудителя.

В некоторых случаях производят количественное определение микроорганизмов. Это особенно актуально при заболеваниях, вызванных условно-патогенными микроорганизмами. Так как данные бактерии проявляют свое негативное воздействие лишь при избыточном количестве.

Также количественный анализ ПЦР важен для выбора терапевтической тактики и с целью контроля над лечением таких вирусных инфекций, как ВИЧ и вирусы гепатита.

Насколько точна ПЦР диагностика инфекций?

Метод ПЦР отличается высокой точностью, специфичностью и чувствительностью. Это означает, что данный анализ способен:

точно определить наличие или отсутствие инфекции;
точно указать, что именно это за инфекция (специфичность);
обнаружить инфекцию даже при очень низком содержании ДНК микробов в биологическом материале,
который был подвергнут исследованию (чувствительность).

ПЦР анализ: цена и сроки

Цена конкретного анализа будет зависеть от того, на какую инфекцию вы будете проверяться. Примерные цены и сроки:

ИППП: 300-500 руб, сроки – 1 день;
Вирус Эпштейна-Барра, вирус папилломы человека, герпеса, цитомегаловирус: 300-500 руб, сроки – 1 день;
Гепатит A, B, C, D, G: качественный анализ 650 руб, количественный анализ 2000 руб. Сроки – до 5 дней;
Антитела к вирусу гепатита С, суммарные ( Anti-HCV ) – 420 руб;
Антитела к вирусу гепатита C, IgM ( Anti-HCV IgM ) – 420 руб;
Хеликобактер пилори (Helicobacter pylori): 300-400 руб, сроки – 1 день;
ВИЧ (антитела и антигены) – 380 руб;
РНК ВИЧ, качественно – 3 500 руб;
РНК ВИЧ, количественно – 11 000 руб.

Чтобы сэкономить средства, можно выбирать фиксированный пакет анализов. Такую услугу предоставляет большинство клиник где можно сдать анализ методом ПРЦ (инвитро, онклиник и т.д).

Источник

Проверка методом ПЦР на наличие коронавируса позволяет с высокой точностью выявить инфицированных людей. Это высокоточное направление молекулярно-генетической диагностики, которое помогает обнаружить даже скрыто протекающую инфекцию. Перед выполнением тестирования требуется определенная подготовка для исключения ложноположительного или ложноотрицательного результата.

Особенности ПЦР-диагностики

С помощью ПЦР, или полимеразной цепной реакции, можно определить участки РНК, специфичные для возбудителей коронавирусной инфекции, в забранном у потенциального больного биоматериале. Это «золотой стандарт» биохимической диагностики любых патологий, спровоцированных не только вирусами, но и бактериями, грибками, простейшими. Методика основана на определении фрагментов РНК инфекционных возбудителей их многократным клонированием.

Одно из преимуществ ПЦР — обнаружение зараженных людей, у которых коронавирус не проявляется какими-либо симптомами. Проведение полимеразной цепной реакции позволяет выявить людей с латентным течением инфекции при малоинформативности вирусологических и серологических методов. Ее внедрение в клиническую практику сделало возможным быстрое тестирование зараженных коронавирусом (в течение одного-двух дней), даже если в их организме присутствуют мельчайшие фрагменты РНК патогенов.

Тестирование новорожденных

Группы особого риска — младенцы и дети до года. Как и пожилые люди, они подвержены риску тяжелого течения острых респираторных инфекций, включая коронавирусную. Это связано с тем, что после 65 лет функциональные системы защиты ослабевают, а у новорожденных они еще не сформировались. Среди детей отмечено мало случаев коронавируса, и пока не установлено достаточно его специфических признаков.

Но именно у новорожденных опасная патология может проявляться следующим образом:

высокой температурой тела (выше 39,5°C);
дыхательной недостаточностью в виде частого поверхностного дыхания, посинением носогубного треугольника;
сильным кашлем, во время приступов которого у младенцев краснеет лицо, в тяжелых случаях — останавливается дыхание.

Опасен ли коронавирус для новорожденных? Несомненно, поэтому врачи незамедлительно приступают к лечению. Они могут дополнять терапевтические схемы препаратами для укрепления иммунной защиты малышей. Ведь у многих из них болезнь проходила очень тяжело: на грани дыхательной недостаточности и отказа внутренних органов из-за ослабленных легких.

В условиях пандемии первоочередной задачей становится диагностирование коронавирусной инфекции при первых ее симптомах. И ПЦР особенно хорошо справляется с этой задачей. Перед ее проведением не требуется забора крови у ослабленных детей — достаточно мазка из носоглотки.

Новорожденные в масках
Проверка новорожденных на коронавирус методом ПРЦ практикуется и в нашей стране, и за рубежом

Во время острого течения коронавируса у новорожденного ребенка высока вероятность обезвоживания. Причина — угнетение аппетита, рвота и водянистая диарея на фоне высокой температуры тела. При потере 10% жидкости организмом возможен летальный исход.

Как проводится ПЦР-тестирование

Полимеразная цепная реакция отличается повышенная чувствительностью и избирательностью. Это помогает обнаружить коронавирусы в очень малых концентрациях. С помощью ПЦР можно не только выявить патогены, но и идентифицировать их видовую принадлежность.

На заметку
Многократное удвоение специфических фрагментов нуклеиновых кислот с последующей идентификацией коронавирусов — принцип действия современных экспресс-тестов. Если лабораторная диагностика занимает 1-2 дня, то с помощью тест-систем возможно выявить зараженных в течение нескольких часов.

После забора у взрослого или ребенка биологического образца для анализа происходит его обработка. Чтобы выделить РНК коронавирусов, из материала удаляются белки, кровь, слизь. Для этого проба пропускается через сорбент, на поверхности которого оседают посторонние примеси. Затем выполняется промывание биообразца, центрифугирование, высушивание. В итоге остается осадок, после растворения которого получается очищенная РНК в жидкости — подвижной фазе, взаимодействующей с адсорбентом хроматографической колонки. Теперь в 2 этапа проводится непосредственно полимеразная цепная реакция.

Клонирование

Для ПЦР нужен амплификатор — специальный прибор-термостат, задачей которого является обеспечение периодического нагревания и охлаждения пробирок с полученным раствором. Для одной ПЦР-диагностики требуется около 30 циклов. Каждый из них включает денатурацию РНК, отжиг и элонгацию (этап биосинтеза молекул нуклеиновых кислот) матричной цепи. Для этого используется набор реактивов — праймеры, являющиеся синтетическими олигонуклеотидами, комплементарными концам искомого фрагмента, дезоксинуклеотидтрифосфаты, буферный раствор.

ПЦР-анализатор — специальное лабораторное оборудование, весьма востребованное во время пандемии коронавируса

В результате нагревания смеси и последующей денатурации цепи РНК коронавирусов расходятся, так как рвутся водородные связи между ними. А после постепенного снижения температуры с РНК связываются специфические праймеры. После 30 циклов даже из одного микроскопического фрагмента коронавируса получается огромное количество копий. Его более чем достаточно, чтобы обнаружить, идентифицировать инфекционного возбудителя, дать ему качественную и количественную оценку.

Электрофорез

На завершающей стадии клонирования в пробирке получается субстрат с многочисленными РНК коронавирусов (при условии, что патогены были в исследуемом образце). Он равномерно распределяется по лункам, внутри которых находится агарозный гель. После подключения анализатора к источнику тока запускается электрофорез, или электрокинетическое явление перемещения частиц дисперсной фазы. Нуклеиновые кислоты, подвергшиеся воздействию электрического тока, разделяются. Теперь их можно без труда рассмотреть в трансиллюминаторе. При ультрафиолетовом излучении они выглядят как светящиеся полоски оранжевого цвета.

Real-Time PCR

Помимо стандартной лабораторной ПЦР-диагностики во время пандемии широко применяется Real-Time PCR. Он не требует визуализации продуктов реакции с помощью электрофореза — их накопление фиксируется в реальном времени оптическими датчиками, вмонтированными в аппарат для клонирования РНК коронавирусов и настроенных на определенную длину волны, испускаемой флуоресцирующими метками.

Real-Time PCR позволяет определять не только наличие нуклеотидной последовательности в биообразце, но и измерять количество копий матрицы. Для чего это нужно:

можно сделать выводы о стадии и динамике коронавирусной инфекции;
удается с высокой точностью оценить эффективность этиотропного лечения.

Происходит автоматическая регистрация и интерпретация полученных результатов. Real-Time PCR не нуждается в стадии электрофореза, что позволяет снизить требования, предъявляемые к ПЦР-лаборатории.

Забор биоматериала

Для проведения полимеразной цепной реакции можно использовать слюну, венозную кровь. Но основным видом биоматериала для тестирования на коронавирусную инфекцию является слизистый секрет, образующийся на стенках носоглотки. Забор в медицинских учреждениях выполняется средним медицинским персоналом или врачом следующим образом:

правой рукой медработник берет пластиковый зонд с ватным тампоном;
затем легким вращательным движением он вводит его в носовой ход или рот на глубину 1,5-2 сантиметра;
не касаясь краев пробирки, зонд помещается в пробирку, которая находится во время забора в левой руке медработника.

Взятие мазка из зева
В качестве биоматериала для проведения ПРЦ-диагностики на коронавирус используется преимущественно мазок из ротоглотки

После отламывания кончика зонда пробирку закупоривают и отправляют в контейнере-холодильнике в лабораторию для исследования. Чтобы его результаты были сразу максимально достоверными, нужно подготовиться:

за сутки отказаться от кофе, алкоголя;
не подвергать себя повышенным физическим нагрузкам;
в день сдачи биоматериала не чистить зубы и не полоскать горло.

Необходимо не курить хотя бы за 30 минут до сдачи крови и согласовать использование или отмену лекарственных препаратов с лечащим врачом. Последнее условие особенно важно, так как прием препаратов с противомикробными, противовирусными или антибактериальными свойствами может исказить результаты ПРЦ-диагностики.

Полезная информация
Транспортировочные контейнеры с биоматериалом обязательно опечатываются и маркируют. После этого они отправляются в лабораторию для ПРЦ-исследования сопровождающими в специальной защитной одежде, которыми был пройден инструктаж по технике безопасности.

Расшифровка результатов

Тест на коронавирус преследует несколько целей, но основная — выявление в организме инфекционных возбудителей нового типа. Расшифровкой результатов занимаются специалисты лабораторий с высшим медицинским образованием. Они могут быть положительными или отрицательными. Последние указывают на отсутствие патогенов в биоматериале. А положительный результат свидетельствует о протекающем в организме инфекционно-воспалительном процессе.

Что может стать причиной ложноположительной реакции:

неправильный сбор, хранение и транспортировка образцов;
нарушение методики проведения полимеразной цепной реакции.

Ложноотрицательные результаты практически почти исключены. Крайне редко они могут быть получены из-за латентного течения инфекции в организме человека.

ВНИМАНИЕ! Проведение количественного ПРЦ-исследования обычно необходимо для подбора оптимальных доз препаратов, а также определения продолжительности терапевтического курса.

Где сдать анализ

Бесплатное ПРЦ-тестирование на наличие коронавирусов делают в государственных лабораториях и исключительно по направлению врача. Оно обязательно для людей из группы риска:

вернувшихся из стран с неблагоприятной ситуацией по коронавирусу менее двух недель (максимальная длительность инкубационного периода);
имевших близкие контакты в течение двух последних недель с людьми, которые заболели коронавирусной инфекцией;
имеющих постоянные контакты с больными в процессе ухода.

Сколько делается анализ? В среднем он не занимает более суток. Но в период пандемии редко когда человек получает результаты ранее 3 дней.

Платно биоматериал можно сдать в специализированных лабораториях, аккредитованных Роспотребнадзором, оборудованных необходимой аппаратурой и тест-системами. Стоимость тестирования зависит от его вида (качественного или количественного), загруженности медицинского учреждения, цены используемых реактивов. Вызов сотрудников лаборатории на дом обойдется на порядок дороже. Стоит учесть, что проверится платно не получится при наличии симптомов какой-либо респираторной или кишечной инфекции.

ПЦР — качественный метод, направленный на выявление возбудителя вирусной инфекции COVID-19. Анализ предназначен для скринингового обследования пациентов. Его специфичность исключает возможность ложных результатов, так как перекрестная реакция антигенов невозможна. Поэтому именно с помощью ПРЦ выполняется тестирование пациентов из группы особого риска, включая новорожденных.

Источник