Электрохимический метод анализа глюкозы в крови
Диабет во всем мире является неизлечимым смертельно опасным заболеванием — согласно оценкам Всемирной организации здравоохранения, в мире насчитывается 350 миллионов больных диабетом с годовой летальностью в среднем около 1%. К счастью, достижения современной медицины позволяют диабетикам контролировать уровень глюкозы и ее поступление, что значительно снизило опасность заболевания во многих странах. Большинство больных диабетом должны контролировать уровень сахара в течение дня, и для этого необходим точный метод измерения концентрации глюкозы в крови. В конструкции современных датчиков используется электрохимический метод измерения.
Принцип измерения уровня глюкозы
Контроль диабета, заключающийся во взятии проб крови пациента несколько раз в день, мягко говоря, является инвазивным и неудобным. Продолжающиеся исследования в области электрохимии позволяют создавать все более быстрые и точные методики измерения уровня глюкозы, которые к тому же требуют сбора гораздо меньшего количества крови. Кроме того, с помощью электрохимических методов можно значительно снизить существующие неудобства, связанные с контролем диабета.
«Проверка уровня глюкозы» (David-i98) — собственная работа. Из Википедии.
Электрохимические методы определения уровня глюкозы основаны на обнаружении оксидаз глюкозы (GOx), которые являются биологическими ферментами, окисляющими молекулы глюкозы до глюконовой кислоты. В природе окисление достигается за счет биологического окислителя, например, кофермента FAD+ (этот кофермент фактически является катализатором, поскольку он может окислиться обратно до исходного состояния при участии растворенного кислорода).
В электрохимической ячейке такой процесс окисления может протекать на поверхности электрода, при этом электроны попадают в электрическую цепь и создают в ней ток, величина которого может быть измерена. В хорошо спроектированном датчике сила тока будет пропорциональна количеству глюкозы, вступившей в реакцию с ферментом, а значит, и текущей концентрации глюкозы. Данная концепция следует из новаторских исследований американского ученого-медика Леланда Кларка (Leland Clark).
Благодаря специфичности биологического фермента GOx датчик позволяет однозначно определять уровень глюкозы даже в такой смеси, как кровь, содержащей большое количество химических соединений. Наконец, указанная методика была дополнена использованием окислительно-восстановительных медиаторов, которые являются более эффективными реагентами, чем кислород, что способствует более точным измерениям без влияния внешних воздействий.
Зачем моделировать измерение уровня глюкозы программными средствами?
Многие компании в мире производят датчики глюкозы для использования пациентами. В настоящее время процесс разработки миновал стадию проверки концепции. Оптимальные датчики глюкозы, выпускаемые в настоящее время, должны соответствовать новейшим технологическим требованиям с учетом экономических и производственных ограничений.
Хотя принцип работы электрохимического датчика уровня глюкозы весьма прост, его реализация может оказаться сложной. Поскольку датчик должен работать в разных условиях, необходимо продуманное решение, обеспечивающее прямую корреляцию измеряемого тока и концентрации глюкозы в образце. На практике затруднения могут заключаться в изменении концентрации кислорода в крови, а также в присутствии других химических веществ, которые вступают в аналогичные реакции с глюкозой. Помимо этого, возможно изменение температуры датчика под воздействием крови, имеющей температуру тела. Все вышеперечисленные факторы могут оказывать влияние на измеряемый электрический ток в датчике.
Программная среда COMSOL Multiphysics является идеальным средством для решения прикладных двумерных и трехмерных задач электроанализа. Почему? В этой среде можно с легкостью объединить моделирование электрохимических процессов с другими физическими явлениями, например, тепломассообменом. Более того, возможность добавлять определяемые пользователем переменные и уравнения позволяет включать в модель нестандартные или сложные явления типа ферментативной кинетики. Нередко теоретическая модель разрабатывается на основе экспериментальных данных о поведении электрохимической системы. Поэтому от методов численного моделирования требуется высокая гибкость.
Пример датчика, измеряющего уровень глюкозы
Простую модель датчика уровня глюкозы можно найти в Библиотеке моделей COMSOL Multiphysics. Датчик в этом модели использует «встречно-штыревой электрод», в котором анод и катод ячейки датчика разделены на большое количество «штырьков», расположенных параллельно друг другу, что позволяет достичь максимальной плотности тока и чувствительности системы. Поскольку длина «штырьков» обычно значительно превышает их ширину, ею можно пренебречь и упростить задачу до двухмерной элементарной ячейки.
Модель учитывает массообмен глюкозы и окислительно-восстановительных медиаторов за счет диффузии и потоков данных веществ в систему и из нее. Кроме того, катализируемая ферментом реакция между окислительно-восстановительными медиаторами и глюкозой вводится в модель посредством заданного пользователем закона Михаэлиса-Ментен для скорости кинетической реакции (он подробно описан в предыдущей заметке моего коллеги Эяла Спира (Eyal Spier) Enzyme Kinetics, Michaelis-Menten Mechanism (Ферментативная кинетика, механизм Михаэлиса — Ментен)).
На нижнем рисунке показана концентрация ферроцианидного окислительно-восстановительного медиатора при протекании установившегося тока в датчике.
На аноде (рабочем электроде) снизу в центре данное вещество окисляется с восстановлением другого окислительно-восстановительного соединения, феррицианида, что приводит к уменьшению концентрации. На катоде (противоположный электрод) в нижних левом и правом углах элементарной ячейки ферроцианид регенерируется и диффундирует обратно к рабочему электроду в «окислительно-восстановительном цикле», что обеспечивает высокую плотность тока.
На следующем графике показана зависимость силы тока от концентрации глюкозы для рабочего датчика (синяя линия), на которой видно, что отклик идеализированного датчика является линейным в исследуемом диапазоне концентраций глюкозы.
Тем не менее, нарушить работу датчика нетрудно (зеленая линия). Для этого представим, что скорость окисления ферментом самой глюкозы в 10 раз ниже. Это условие можно задать, уменьшив коэффициент ферментативной кинетики v_mathrm{max}. В этом случае линейность отклика при тех же концентрациях не обеспечивается. Это показывает, что для того, чтобы измеряемый ток в датчике глюкозы действительно отражал уровень ее концентрации, необходимо тщательное проектирование. Вы можете попробовать самостоятельно варьировать параметры модели, чтобы выяснить влияние других эффектов.
Совет: ознакомьтесь с моделью Glucose Sensor (Датчик глюкозы) в Галерее моделей.
Источник
ЮНИТЕКА:
Биохимия:
19.11.2009
Герасименко В.А., к.м.н., Куриляк О.А., к.б.н.
Из архива газеты «Новости А/О Юнимед»
Определение концентрации глюкозы в крови – одно из наиболее часто выполняемых биохимических исследований в КДЛ. Причина исключительной популярности теста связана с высокой заболеваемостью сахарным диабетом. Данный тест выполняется как в условиях стационара, так и в поликлиниках. Больные сахарным диабетом вынуждены исследовать уровень глюкозы в крови в домашних условиях, поскольку без этой информации им трудно скорректировать свою диету, физические нагрузки, применение инсулина и других сахароснижающих препаратов. Исключительная важность теста и большие объемы выполняемых исследований стимулировали разработчиков к созданию различных типов приборов и методов определения концентрации глюкозы в крови.
В настоящее время существует достаточно много методов определения глюкозы. Их можно классифицировать следующим образом.
Методы определения глюкозы в сыворотке крови
1. Редуктометрические. Почти не используются
2. Колориметрические. Почти не используются
3. Ферментативные:
а) глюкозооксидазный
— фотометрический по конечной точке
— фотометрический кинетический
— отражательная фотометрия – сухая химия
— электрохимический
б) гексокиназный.
Первые два метода крайне неудобны, токсичны и обладают низкой точностью, поэтому мы на них не будем останавливаться.
Глюкозооксидазный метод
Сегодня наибольшее распространение получили методы, основанные на использовании фермента – глюкозооксидазы. В основе метода лежит следующая реакция:
Глюкозооксидаза катализирует перенос двух водородных атомов с первого углеродного атома глюкозы на кислород, растворенный в жидком реагенте. При этом в ходе реакции образуется в эквимолярных количествах перекись водорода. Т.е. концентрация образовавшейся перекиси водорода точно равна определяемой концентрации глюкозы. Следовательно, использование глюкозооксидазной реакции, трансформировало задачу определения концентрации глюкозы в задачу определения концентрации перекиси водорода, которая, как будет показано ниже, значительно проще первой. И здесь есть несколько способов, широко используемых сегодня в лабораторной практике (см. схему).
Среди вышеперечисленных способов регистрации наибольшее распространение получил фотометрический биохимический метод, в котором молекулы перекиси водорода под действием фермента пероксидазы расщепляются с образованием активной формы кислорода – супероксид анион-радикала – О2-, который в свою очередь окисляет хромоген, что приводит к значительному изменению спектра поглощения хромогена.
На рис. 1 и 2 показаны спектры рабочего раствора до внесения в него стандартного раствора глюкозы и после. Максимум поглощения реакционной смеси – (реактив + глюкоза) находится в области 500 нм. Соответственно, изменение оптической плотности конечной реакции на длине волны 480-520 нм пропорционально концентрации глюкозы, содержащейся в пробе.
Рисунок 1. Спектр рабочего раствора
Рисунок 2. Спектр реакционной смеси (рабочий раствор + глюкоза)
Большая популярность данного метода определения глюкозы объясняется его высокой специфичностью и простотой выполнения. Метод можно реализовать как с применением обычного фотометра (лучше специализированного биохимического фотометра типа Микролаб 540), так и с помощью автоматических биохимических автоанализаторов.
Глюкозооксидазный метод признан сегодня одним из самых точных количественных методов определения глюкозы. В качестве биологического материала используется как сыворотка крови, так и цельная кровь. При работе с последней следует учитывать тот факт, что при взятии капиллярной крови доля сыворотки (плазмы) зависит от величины гематокрита, что может негативно отразиться на точности результата. Поэтому при определении глюкозы вышеописанным методом предпочтительно использовать сыворотку крови пациента.
Наряду с методом фотометрирования по конечной точке, несколько лет назад появились наборы, в которых реализован кинетический метод фотометрирования. Суть метода состоит в том, что при определенном соотношении активностей глюкозооксидазы и пероксидазы, скорость образования окрашенного соединения некоторое время после внесения пробы в рабочий раствор будет пропорциональна концентрации глюкозы в пробе. Преимущество такого метода состоит в том, что результат не зависит от наличия в пробе других соединений, поскольку поглощение последних стабильно во времени. Этот метод требует применения кинетического фотометра, например Stat Fax 1904+, Stat Fax 3300, полуавтоматических анализаторов, например Clima 15, или автоматических биохимических анализаторов. Измерение концентрации глюкозы из цельной крови удобно выполнять с помощью приборов, работа которых основана на амперометрическом принципе измерения, при помощи специальных ферментных датчиков. Перекись водорода является крайне нестабильным химическим соединением и она может служить источником заряженных частиц. Именно это и используется в ферментных датчиках мембранного типа или электрохимических элементах портативных глюкометров.
Рисунок 3. Измерительная ячейка
В измерительной ячейке, сконструированной как проточная, находится измерительная камера, с одной стороны ограниченная ферментной мембраной (Рис. 3). На мембрану толщиной около 60 микрон специальным образом сорбирована глюкозооксидаза. С другой стороны мембраны к ней прижимается платиновый электрод.
Проба цельной крови (обычно 20 мкл) разводится в системном буферном растворе (эритроциты разрушаются), после чего подается по магистрали в проточную ячейку. Глюкоза, подвергается окислению под воздействием фермента глюкозооксидазы, находящейся на мембране. Образовавшаяся перекись водорода диффундирует через мембрану и окисляется далее в каталитической реакции под действием платины. Диффузия перекиси водорода на поверхность платины формирует ток, пропорциональный числу молекул Н2О2. Полученный таким образом сигнал обрабатывается прибором в соответствующее значение напряжения. Это измеренное значение пропорционально концентрации глюкозы в пробы.
В качестве примера приборов, использующих вышеописанный метод можно назвать автоматические анализаторы глюкозы Biosen (Германия). Эти приборы удобны для использования не только в стационарах, но и в поликлиниках, где анализ на глюкозу делают преимущественно из капиллярной крови.
Важным этапом в развитии методов клинической лабораторной диагностики стало появление «сухой химии». Естественно, одним из первых приложений этой технологии стала задача определения глюкозы в крови пациента. Первые приборы значительно уступали по точности традицинным лабораторным методам исследований. Однако, со временем, ряду фирм удалось разработать такие диагностические полоски и отражательные фотометры, которые обеспечили весьма высокую точность анализа. Широко популярными во всем мире в настоящее являются глюкометры One Touch и тест-полоски к ним производства компании Life Scan (США), которые удачно сочетают в себе аналитическую точность количественного ферментативного метода со скоростью и простотой «сухой химии».
Глюкометры One Touch предназначены для быстрого и точного измерения уровня глюкозы в цельной крови. Тест-полоска One Touch содержит все необходимые химические компоненты для двухэтапного глюкозооксидазного метода, включая ферменты глюкозооксидазу и пероксидазу, которые сорбированы на уникальную пористую гидрофильную мембрану. Результатом реакции является образование окрашенного комплекса. Интенсивность развившейся окраски регистрируется отражательным минифотометром.
Рисунок 4. Конструкция тест-полоски
В дополнении к этому, мембрана обладает гидрофильными свойствами, благодаря которым капля крови “притягивается” к поверхности тест-полоски при касании.Мембрана тест-полоск One Touch напоминает губку с микроскопическими порами и выполняет тройственную функцию. Она действует: 1) как резервуар, собирая необходимое количество крови, 2) как фильтр, блокируя твердый клеточный материал (эритроциты, лейкоциты и др.), 3) как гладкая оптическая поверхность, на которой измеряется отраженный свет. Последняя функция, в частности, очень важна для работы прибора. Она делает возможным считывать нижнюю часть полоски, тогда как кровь остается на верхней части тест-полоски. Соответственно, нет необходимости стирать (промокать) кровь с поверхности тест-полоски.
В состав приборов One Touch входит два специальных светодиода. Обработка развившейся окраски на тест-полоске идет следующим образом. Как только тест-полоска вставлена в прибор – происходит нулевое считывание. В этот момент на дисплее мы видим: “ЖДАТЬ”. Когда капля крови наносится на тест-полоску, плазма крови моментально сорбируется мембраной, тогда как эритроциты и излишки плазмы остаются на поверхности мембраны. После полного впитывания капли крови немедленно происходит окрашивание. Прибор регистрирует изменение величины отражения и автоматически запускает таймер. Через 45 секунд химическая реакция заканчивается, результат светоотражения обрабатывается. Окрашенный продукт реакции поглощает свет, испускаемый первым светодиодом. Форменные элементы крови и лишняя плазма также поглощают свет, излучаемый диодом. Чтобы скорректировать фоновое отражение, второе считывание производится вторым светодиодом на другой длине волны. Разность сигналов от первого и второго светодиода несет информацию о поглощении света хромогеном. Сигнал, полученный от хромогена для оценки концентрации глюкозы, соотносится со специальной калибровкой. Все приборы One Touch откалиброваны с использованием референтного метода на лабораторном анализаторе глюкозы. С помощью этой процедуры получается стандартная калибровочная кривая. Отметим, что достаточно сложно наладить производство тест-полосок, которые были бы абсолютно одинаковыми химически, в силу очень низкой концентрации реактивов. Для решения этой проблемы используется стандартная калибровочная кривая, состоящая из 16 –ти калибровочных линий. Контроль качества осуществляется сразу после производства тест-полосок, что позволяет определить, какая из калибровочных линий (от 1 до 16) может быть применена для данной тест-полоски. Это так называемый номер кода, который проставляется на упаковке тест-полосок. Эти 16 калибровочных линий также программируются в микропроцессоре прибора. Для получения оптимально точных результатов, номер кода, указанный на упаковке тест-полосок выставляется в приборе при помощи кнопки кода. Таким образом, неправильно установленный код на приборе может являться причиной ошибки измерения.
С момента появления на рынке приборов One Touch прошло большое количество клинических исследований в лабораториях России, Америки и Европы. Одно из таких исследований было проведено Эндокринологическим научным центром РАМН по заказу Российской Ассоциации Медицинской Лабораторной Диагностики. Специалисты Центра провели сравнительный анализ двух методов измерения уровня глюкозы в крови. Результаты, полученные на One Touch, сопоставлялась с данными, полученными на биохимическом анализаторе Spectrum II (Abbott Laboratories, США), реализующем гексокиназный метод определения глюкозы. Было исследовано 190 проб крови от 95 пациентов. Коэффициент корреляции результатов составил 0,98641. Коэффициент вариации в нормальном и патологическом диапазонах на глюкометре One Touch не превысил 2,5%.
Рис. 5. Корреляционная зависимость показаний “One Touch” и «Спектрум-2» (коэффициент корреляции 0,98641)
В заключении следует упомянуть и о недостатках глюкозооксидазного метода. Образующаяся перекись водорода и супероксид анион-радикал могут окислять не только хромоген, но и другие вещества, присутствующие в биологической жидкости: аскорбиновую кислоту, мочевую кислоту, билирубин. При этом, соответственно, доля перекиси, принимающая участие в окислении хромогена, снижается, что приводит к занижению результата по глюкозе. Этот метод линеен, как правило, до 20-30 ммоль/л глюкозы.В официальном отчете Эндокринологического научного центра РАМН сказано: «приборы One Touch обладают высокой точностью и правильностью, а также широким диапазоном измерений. Их можно использовать для диагностики неотложных состояний при диабете, в том числе бригадами “Скорой помощи”, поскольку эти приборы не только надежны, но и быстро дают результаты».
Гексокиназный метод
Гексокиназный метод состоит из двух последовательных реакций, но совершенно других:
Регистрация осуществляется при длине волны 340 нм по светопоглощению НАДН. Этот метод является высокоспецифичным и не дает реакции с другими компонентами сыворотки крови. Гексокиназный метод считается референтным для определения глюкозы. Как правило, он линеен до 50 ммоль/л, что позволило его широко рекомендовать для клиник с эндокринологическими отделениями.
Из описанного разнообразия методов определения глюкозы сотрудники КДЛ могут решить для себя, какой способ определения и какой прибор выбрать:
- Методы «мокрой» биохимии, реализованные на автоматических биохимических анализаторах, обеспечат нужды лабораторий с большим потоком анализов.
- Анализаторы глюкозы типа Biosen требуют от оператора минимальных трудозатрат, так как они полностью автоматизированы и достаточно производительны (скорость от 50 до 200 проб в час).
- Для лабораторий с небольшим числом исследований, а также экспресс-лабораторий удобен специализированный биохимический фотометр Микролаб 540.
- Для бригад скрой помощи идеальное решение — глюкометры типа One Touch.
Т.о., задача КДЛ обеспечить не только быстрое, но и высокоточное определение глюкозы, на сегодняшний день вполне решаема.
Источник
