Анализ сахара в крови по хагедорну

Общее содержание сахаров в крови здорового человека составляет (в том числе глюкозы ).

Для количественного определения глюкозы в крови чаще всего пользуются микрометодом Хагедорна — Иенсена. Суть его состоит в том, что глюкоза окисляется железосинеродистым калием (красной кровяной солью) в щелочной среде до глюконовой кислоты, при этом красная кровяная соль восстанавливается до желтой (железистосинеродистого калия).

Реакция доходит до конца лишь в присутствии ионов Образуется нерастворимый цинк — железистосинеродистый калий

Избыток железистосинеродистого калия, не израсходованный на окисление глюкозы, определяется иодометрическим путем

Выделившийся иод оттитропывают тиосульфатом натрия (гипосульфитом):

Реактивы: а) оксалатная кровь. Кровь берут из ушной вены кролика. Чтобы предупредить ее свертывание, к 10 мл крови добавляют 0,01 г щавелевокислого натрия. Можно также брать кровь из пальца; б) содовый раствор железосинеродистого калия: 1,65 г и 10,6 г безводного углекислого натрия растворяют в мерной колбе на 1 л. Раствор хранят в склянке из темного стекла; в) тиосульфат натрия (гипосульфит, серноватистокислый натрий), 0,005 н раствор; г) едкое кали, 0,1 н раствор; д) сернокислый цинк. Готовят 45%-ный раствор сернокислого цинка перед употреблением его разводят в 100 раз, получая -ный раствор; е) хлорцинковый раствор: 10 г сернокислого цинка и 50 г хлористого натрия растворяют в 100 мл воды в мерной колбе на 200 мл, раствор доводят водой до метки и фильтруют; ж) иодистый калий: 5 г соли (не содержащей свободного иода) растворяют в 25 мл воды. Раствор готовят перед употреблением; з) уксусная кислота, -ный раствор; и) крахмал, -ный раствор.

В четыре пробирки наливают по н раствора едкого натра и -ного раствора сернокислого цинка. Выпадает студенистый осадок гидрата окиси цинка. В две пробирки сухой микропипеткой вносят по 0,1 мл крови. Пипетку погружают в раствор гидрата окиси цинка почти до дна пробирки, осторожно выпускают кровь и хорошо перемешивают ее с содержимым пробирки, 2—3 раза втягивая и выпуская жидкость. В две другие пробирки вносят по 0,1 мл дистиллированной воды (контроль). Все пробирки ставят в кипящую водяную баню точно на 3 мин. Белки крови выпадают в виде бурых сгустков. Содержимое четырех пробирок фильтруют через вату в четыре сухих пронумерованных стаканчика. Кусочки ваты в воронках до фильтрования промывают горячей дистиллированной водой (по 2 мл). Пробирки, в которых осаждали белок, ополаскивают 2 раза горячей водой (по 2-3 мл), присоединяя

промывные воды к основным фильтратам (через те же воронки с ватой). Фильтрат должен быть прозрачным.

Во все четыре стаканчика добавляют точно по 2 мл содового раствора железосинеродистого калия, а затем нагревают на кипящей водяной бане 15 мин. После охлаждения в каждый стаканчик доливают по 2,6 мл хлор-цинкового раствора, раствора иодистого калия и -ного раствора уксусной кислоты. Выделившийся иод оттитровывают из микробюретки 0,005 н раствором тиосульфата натрия (индикатор — раствор крахмала).

На титрование контрольной пробы должно быть израсходовано около н раствора тиосульфата. В опытных образцах объем раствора тиосульфата, израсходованный на титрование, обратно пропорционален содержанию глюкозы в крови.

Для расчета содержания глюкозы пользуются табл. 7.

Пример расчета. На титрование исследуемого образца израсходовано н раствора тиосульфата, контрольного — 2 мл. По табл. 7 находим, что раствора тиосульфата соответствуют 0,125 мг глюкозы, а 1,92 мл того же раствора — 0,014 мг.

Содержание глюкозы в 0,1 мл крови равно мг, а в мг.

Сахар крови (определение по Хагедорну и Иенсену). Реактивы. 0,45%-ный раствор сернокислого цинка (заготавливают в запас 45%-ный раствор сернокислого цинка и по мере надобности готовят из него стократное разведение не реже чем раз в 10—14 дней). 0,1 н. раствор едкого натра. Титр может быть не вполне точным, но концентрация его не должна превышать указанную. Смесь этих двух реактивов, приготавливаемая перед употреблением, служит для осаждения белков. Содовощелочной раствор железосинеродистого калия (красной кровяной соли). Раствор готовят из химически чистого препарата, но лучше всего  его очистить перекристаллизацией. Кристаллы промывают несколько раз холодной водой и затем растворяют в кипящей воде. Раствор фильтруют в фарфоровую чашку, которую помещают в лед. Избыток воды с выпавших на холоду кристаллов удаляют фильтровальной бумагой, кристаллы помещают для высушивания в сушильный шкаф при 50° или термостат. Очищенный реактив неограниченно стоек. Точно отвешивают на весах 1,65 реактива, помещают в мерную колбу емкостью в 1 л, растворяют в воде, добавляя 10,6 безводного углекислого натрия, и доводят водой до метки. Раствор хранят в темной бутыли на холоду в течение 2 месяцев.

Хлор-цинк-йодистый раствор. Сернокислого цинка 50,0 и хлористого натрия 250,0 растворяют в 1 л воды, если нужно, фильтруют; перед употреблением отвешивают такое количество йодистого калия, чтобы получить 2,5%-ный раствор; например, к 50 мл хлор-цинк-натриевого раствора прибавляют 1,25 йодистого калия.

3%-ная уксусная кислота (3 мл ледяной уксусной кислоты отмеривают в мерную колбу емкостью 100 мл и доливают дистиллированной водой до метки).
1%-ный раствор крахмала (приготовленный заранее насыщенный раствор хлористого натрия наливают в мерную колбу емкостью 100 мл более чем до половины; 1,0 растворимого крахмала растворяют в пробирке в нескольких миллилитрах дистиллированной воды при нагревании, выливают в ту же колбу и доливают тем же раствором хлористого натрия до метки. Раствор неограниченно стоек. С йодом он дает чисто синее окрашивание).

0,02 н. раствор гипосульфита натрия приготовляется перед употреблением из 0,1 н. раствора, отмеривают точно 5 мл в мерную колбу емкостью 100 мл и доливают прокипяченной и охлажденной дистиллированной воды до метки (для изгнания углекислоты). Титр гипосульфита проверяют по титрованному раствору каждый раз при приготовлении нового раствора и повторяют проверку не реже 1 раза в неделю. С этой целью отливают в стаканчик точной пипеткой 2 мл 0,02 и. раствора йодноватистого натрия, прибавляют 2 мл уксусной кислоты, 2 мл хлор-цинк-йодийого раствора и 2—3 капли крахмала и титруют гипосульфитом из микробюретки до исчезновения окраски.

0,02 н. раствор йодноватокислого калия, 0,3567 г которого отвешивают на аналитических весах и растворяют в 2 л дистиллированной воды.

Для фильтрования свернувшейся при кипячении крови повторно кипятят вату в дистиллированной воде, каждый раз сливая и отжимая воду, затем ее просушивают.

Оборудование. Две микропипетки емкостью 100 мм3; пробирки диаметром 15 мм, по две на каждое исследование (всегда делают параллельное исследование); металлический штатив, вместе с которым пробирки помещают в водяную баню;  стеклянные воронки диаметром 3—4 см; плоскодонные стаканчики или пробирки диаметром 3—4 см и высотой 10—12 ом, желательно с особым штативом; очень точная пипетка Мора емкостью в 2 мл, с двумя метками; пипетки Мора емкостью в 1 и 5 мл; две градуированные пипетки емкостью 10 мл; несколько мерных колб емкостью 50, 100 или 200 мл; микробюретка емкостью 2 мл с делениями на 0,01 мл.

Ход определения. Устанавливают в штативе пробирки в количестве, вдвое большем по отношению к предполагаемому числу исследований; снабжают их соответствующими номерами (параллельные пробирки помечают одним номером); в каждую пробирку отмеривают по 5 мл 0,45%-ного раствора сернокислого цинка и по 1 мл 0,1 н. едкого натра; образуется хлопьевидный осадок гидрата окиси цинка. Набирают в микропипетку емкостью 0,1 мл кровь из пальца, тщательно вытирают кончик пипетки и выдувают кровь в приготовленную смесь, несколько раз набирают ее в пипетку и вновь выдувают, чтобы смыть всю кровь со стенки пипетки.

Пробирки с кровью могут стоять несколько часов без заметного влияния на результаты анализа. Можно набрать таким образом кровь у всех подлежащих исследованию лиц. Штатив с пробиркой переносят в кипящую водяную баню на 3 минуты. В это время заготавливают штатив со стаканчиками, носящими те же номера, что и пробирки. Снабжают каждый стаканчик воронкой, в которую вложен комок ваты, смоченный дистиллированной водой и слегка утрамбованный стеклянной палочкой. Из каждой пробирки жидкость фильтруют в соответствующий стаканчик, после чего в пробирку наливают 3 мл дистиллированной воды, встряхивают, выливают в ту же воронку, еще раз наливают 3 мл воды и выливают в воронку. Фильтрат должен быть совершенно бесцветным и прозрачным. После того как жидкость профильтровалась до последней капли, воронки снимают и в каждый стаканчик добавляют точной пипеткой ровно 2 мл железосинеродистого раствора, после чего штатив со стаканчиками переносят в кипящую водяную баню на 15 минут. Вода в бане все время кипит. После этого штатив со стаканами переносят в тепловатую, а затем в холодную воду. По охлаждении приливают в каждый стаканчик по 2 мл йод-хлор-цинк-натриевого реактива и уксусной кислоты; прибавляют по 3—4 капли крахмала и титруют раствором гипосульфита до полного обесцвечивания. Отмечают количество гипосульфита, пошедшее на титрование каждой из двух параллельных пробирок.

Ставят также «слепой» опыт, т. е. определяют восстановительное действие реактивов, для чего проделывают все вышеописанное только с реактивами, без крови. При этом на обесцвечивание жидкости должно затратиться 1,98—1,96 мл гипосульфита.

Вычисление. Для каждого исследования берут среднее из 2 определений (если расхождение не слишком велико) и ищут по прилагаемой таблице, какому количеству глюкозы оно соответствует. Если титр гипосульфита не совсем точен, в показания микробюретки вносят поправку, согласно фактору раствора. Из найденной величины вычитают то количество глюкозы, которому соответствует восстанавливающее действие самих реактивов. Полученная разность и соответствует количеству миллиграммов сахара (восстанавливающих веществ) в 100 мл крови.

Определение сахара по Хагедорну — Иенсену

Пример. На титрование пробирки с кровью потрачено 0,93 мл гипосульфита, на титрование параллельной пробирки — 0,96 мл. Средняя величина находится между 0,94 и 0,95. Ищем в первом вертикальном столбце таблицы 0,9 и в верхней строчке числа 4 и 5. На месте их пересечения находим 188 и 186, берем среднее 187. Из этого числа следует вычесть цифру «слепого» опыта; предположим, что па титрование ушло 1,97 и 1,96 мл, что соответствует (по таблице) 006. Из 187 вычитаем 006, получаем 181, что означает искомое количество миллиграммов сахара в 100 мл крови (181 мг%).

В норме сахара в крови натощак 80—120 мг%.

• Сахар крови истинный

03.02.2014

Метод основан на способности красной кровяной соли (феррицианида) – K3Fe(CN)6 восстанавливаться в щелочной среде при наличии глюкозы в желтую кровяную соль (ферроцианид) – K4Fe(CN)6, причем оставшийся неизрасходованный избыток феррицианида определяется при наличии уксусной кислоты йодометрическим путем.

Поскольку эта реакция обратима и приводит к равновесию системы и для того чтобы она проходила количественно слева направо, необходимо удалить из реакционной смеси ферроцианид, что и производится при помощи сернокислого цинка (II). Количество феррицианида, которое осталось после реакции, определяют, титруя раствором гипосульфита (III).
Метод служит для определения глюкозы при наличии ее в количестве 0,002–0,382 мг, лучшие результаты получаются в пределах 0,02–0,3 мг.
Применяются следующие реактивы.
1. 0,1-н. раствор едкого натрия. Титр раствора может быть, немного слабее, но не должен превышать 0,1-н.
2. 0,45%-ный раствор сернокислого цинка.
Оба эти раствора служат для осаждения белков, приготавливаются каждые восемь дней заново из 2-н. едкого натрия и 45%-ного раствора ZnSO4.
3. 0,005-н. раствор феррицианида в 0,1-н. растворе углекислого натрия. 1,65 г (точная навеска) чистейшего перекристаллизованного KaFe(CN)6 и 10,6 г безводной соды растворяют в 1 л воды. Смесь может храниться в темноте и на холоде в течение нескольких месяцев.
4. Раствор йодистого калия, сернокислого цинка и хлористого натрия. В качестве запасного служит раствор 50 г сернокислого цинка и 250 г чистого хлористого натрия в 1 л воды. По мере надобности из данного раствора приготовляют рабочий реактив, добавляя лишь такое количество йодистого калия, чтобы его концентрация в смеси составляла 2,5%.
5. 3%-ная уксусная кислота, не содержащая железа.
6. 1%-ный раствор растворимого крахмала в насыщенном растворе хлористого натрия или калия.
7. 0,005-н. раствор гипосульфита на прокипяченной воде, приготовляемый ежедневно соответствующим разбавлением 0,1-н. раствора, как более устойчивого при хранении. Титр устанавливается по раствору йодноватокислого калия (KJO3) той же крепости.
Все реактивы готовятся на дважды перегнанной воде.
Определение. Для осаждения белков к испытуемым вытяжкам (1–2 мл) прибавляют последовательно один объем 0,1-н. раствора NaOH и пять объемов 0,45%-ного ZnSO4 и нагревают 3 мин в кипящей водяной бане, в результате чего осаждается белок. Для отделения осадка жидкость фильтруют через промытую горячей водой вату, помещенную в маленькую воронку, и дважды промывают колбу и фильтр водой (3 мл).
К прозрачному фильтрату (около 15 мл), собранному в пробирку 30х90 мм или колбу, приливают точно 2 мл щелочного раствора феррицианида и ставят на 15 мин в интенсивно кипящую водяную баню. Срок кипения следует строго соблюдать. По истечении 15 мин пробирки или колбы немедленно охлаждают под струей холодной воды. После выравнивания температуры к содержимому прибавляют по 3 мл смеси (4) с йодистым калием, взбалтывают, подкисляют 2 мл уксусной кислоты и титруют выделившийся йод раствором гипосульфита из 2 мл микробюретки до еле заметной желтой окраски. После чего прибавляют две-три капли крахмального раствора и оканчивают титрование в момент полного обесцвечивания.
Одновременно с опытом проводят контрольное определение, в котором исследуемую вытяжку заменяют равным объемом воды. По количеству миллилитров раствора гипосульфита, ушедшего на титрование, вычисляют соответствующее количество глюкозы (в миллиграммах) по прилагаемой табл. 9. Оба результата как опытного, так и контрольного определения перечисляют на глюкозу и по разности, судят о содержании глюкозы по взятой пробе. Вычисление глюкозы по разности в цифрах непосредственного титрования ведет к неправильным результатам.