Анализ крови на терморезистентность эритроцитов методика

Источник

• Авторы
• Резюме
• Файлы
• Ключевые слова
• Литература

Нарушение физико-химических свойств и метаболизма эритроцитов наблюдается при достаточно большом спектре патологических состояний. Но эти изменения могут носить не столь очевидный характер и не выявляются обычными рутинными методами. В этом случае действие экстремального фактора на эритроциты in vitro позволит оценить их адаптивный потенциал и выявить вероятные структурно-функциональные нарушения. Одним из таких подходов к исследованию красных клеток in vitro  является термоиндукция.

Исследования влияния высокой температуры на свойства эритроцитов были начаты достаточно давно. Первоначальные исследования были посвящены изучению действия  высоких температур на физико-химические свойства красных клеток.   

Так, S. Baar проведено исследование влияния эффектов высокой температуры на осмотические свойства эритроцитов. Было показано, что повышение температуры образцов цельной крови в течение 20 минут до 40°C, 45°C, 50°C и 55°C приводило к изменению осмотической резистентности эритроцитов, которое оценивалось по тесту лизиса. При достижении температуры 50°C были установлены различия в термочувствительности красных клеток. Менее всего были устойчивы к действию   высокой температуры клетки «среднего возраста», т.е. те, которым  предстояло жить в системе гемоциркуляции, как минимум, 2 месяца [6].  Изменение осмотической резистентности эритроцитов в условиях термоиндукции также отмечено и другими исследователями  [29].

В более позднем исследовании Baar S. и Arrowsmith D. J. [7] было внесено уточнение относительно термочувствительности эритроцитов разного возраста. Образцы цельной крови подвергали нагреванию до 49°C и 50°C в условиях одинаковой временной экспозиции. По морфологическим изменениям эритроциты были разделены на старые и молодые, причем последние демонстрировали низкую терморезистентность.  

Показано, что при действии высоких температур менялась эластичность мембран эритроцитов. По мнению авторов, изменение эластичности мембран эритроцитов обусловлено денатурацией мембранных белков, причем определен температурный диапазон необратимых переходов: между 46° и 50°С [27].

Самостоятельным направлением являлось изучение термогемолиза эритроцитов. Подробное исследование  этого процесса было проведено Ямайкиной И.В. [5]. Степень гемолиза эритроцитов существенно зависела не только от температуры, но и от длительности её воздействия.  Глушаевой Т.С. и Ягиным  В.В. показано, что при 60-минутной экспозиция эритроцитов  при температуре 40°С количество негемолизированных эритроцитов составило 90,2 %, при температуре 50°С — 85,6 %, при температуре 60°С — 81,2 % [1].

Исследованиями ChoiJ. W., PaiS. Hw. [10] продемонстрировано, что в образцах цельной крови до и после теплового воздействия при 50°С в течение 5 минут не менялись такие параметры как число эритроцитов, концентрация гемоглобина или среднее содержание гемоглобина в эритроците (MCH).  В тоже время, тепловое воздействие достоверно  индуцировало повышение гематокрита и средний объем эритроцита (MCV).

Большой интерес вызывают результаты исследования действия высоких температур на деформабильность эритроцитов. Установлено, что при инкубации эритроцитов при 48-55°C меняется деформабильность красных клеток. Определено время, при котором клетки сохраняют деформабильность в диапазоне температур 48-55°C. Более длительная инкубация приводит к резкому снижению способности к деформации эритроцитов.  По мнению авторов исследования, наиболее чувствительны к  нагреванию белки эритроцитарной мембраны [12].

Проведено исследование влияния сдвига напряжения на деформабильность эритроцитов в условиях термоиндукции. Установлено, что в диапазоне температур  от 2 до 50°С в условиях сдвига напряжения эритроциты приобретали удлиненную форму. Выяснено, что существенное  усиление текучести мембраны эритроцитов имело место при увеличении температуры среды инкубации от 2° до 24-37°С и между 48°и 50°С [31].

Luo Jisheng  Zuo  et al.[24] показано, что нагревание эритроцитов крови здоровых людей в течение 20 минут вызывало деформацию красных клеток, причем значительное изменение формы клеток и гемолиз имели место в диапазоне температур от 48° до 50°C. Белки мембран эритроцитов демонстрировали различную термочувствительность. Так, денатурация некоторых интегральных белков мембран эритроцитов, в частности,  Na+, K+-ATP-азы, наступала при температуре свыше 54 °C.

Повышение температуры влияло не только на деформабильность, но и на обратимость  агрегации эритроцитов при напряжении сдвига [23].

Сравнительно недавно определилось новое направление: исследование эффектов химических или физических факторов на эритроциты в условиях термоиндукции.  Так, показано снижение деформируемости эритроцитов при их прогревании  до 48°С. Сочетанное действие гипертермии и лантана приводило к снижению агрегации эритроцитов  in vitro [4]. Добавление сахарозы в среду инкубации снижало термо-индуцированный лизис эритроцитов [16]. Тарасовой Ю. В. [3]   показано, что экспозиция эритроцитов в течение 30 минут при 50° приводила к усилению сапонин-опосредованного гемолиза, что, по мнению автора,  свидетельствовало о вовлечении в этот процесс белков цитоскелета.

Показано, что при действии высоких температур меняется связывание эритроцитов с химическими веществами, в частности, с билирубином. По мнению авторов исследования, наблюдаемый эффект связан с изменением топографии мембран красных клеток [28]. Leyko W et al.  установлено, что увеличение температуры среды инкубации эритроцитов в диапазоне от 39°С до 49°С повышало интенсивность перекисного окисления липидов мембран эритроцитов, индуцированное смесью 0.1 мМ FeCl3 + 1.5 мМ аскорбат. В тоже время само по себе гипертермическое воздействие не провоцировало активации перекисного окисления липидов в мембранах эритроцитов [22].

Фундаментальным направлением является исследование молекулярных механизмов, участвующих в реализации термического повреждения эритроцитов.  Так, Gershfeld NL, Murayama M. высказано мнение, что термоиндуцированный гемолиз эритроцитов опосредован  состоянием липидного бислоя мембраны [14].   

Зубаировым  Д.М. и соавт. [2]  исследовалось распределение аминофосфолипидов между бислоями мембраны эритроцитов при термическом воздействии. При температурах 50°С и 56°С  через 30 — 120 минут экспозиции зафиксирована презентация  фосфатидилсерина на внешней поверхности эритроцита.

В тоже время высказано мнение, что терморезистентность эритроцитов зависит в большей степени от устойчивости белков.

Клетки и тени мембран эритроцитов подвергали тепловому воздействию в диапазоне температур от 50° и 75°  C. Спонтанная фрагментация целых клеток  наблюдалась при 50° С., т.е. в точке перехода, которая ассоциирована с денатурацией спектрина. Гемолиз наблюдался при 65°С. Образование микровезикул теней зафиксирована при температуре свыше 70°С. Также автор указывает на существенную роль компонентов цитоскелета, которые утрачивают способность к полимеризации/деполимеризации, что и приводит к блеббингу [11].

Lepock J.R. et al. [21] продемонстрировано, что в динамике нарастающего термического воздействия мембраны эритроцитов имеют три транзиции (точки перехода) при 50.0°, 56.8° и 63.8° С. На основании этих исследований была предложена модель термогемолиза эритроцитов. Согласно этой модели, при температуре  50.0° происходит денатурация спектрина, которая хотя и необходима для лизиса клеток, но недостаточна. Лизис мембраны обусловлен денатурацией других мембранных белков, которая происходит при повышении  температуры до 60°C. 

Нарушение фолдинга спектрина происходит при 49.5° С, но денатурация спектрина самого по себе недостаточна для индукции термогемолиза. Активности Ca2+-ATPase и Na+-K+-ATPase снижаются при температуре свыше 45°С и 43°С, соответственно. Это может быть результатом  нарушения фолдинга белков. В тоже время, при нагревании эритроцитов до 49°С в среде инкубации не обнаружено  увеличение содержания белка, который определяли, используя метод Лоури [8]. При прогреве эритроцитов от 46°С до 54° С зафиксировано увеличение выхода калия [25].  Также выявлена зависимость степени гемолиза эритроцитов от времени. После нагревания эритроцитов до 42°С и 47° С после 48 часов процент гемолизированных клеток был выше, чем непосредственно после нагревания [15].

Под руководством Ivanov I.T. [16-20]  была проведена серия исследований механизма реализации нарушений в эритроцитах, индуцированных тепловым воздействием. Прежде всего, было показано, что проницаемость мембран эритроцитов при их нагреве имеет 2 максимума: при 48-52 °C  и 62-67 °C.  Оба эти максимума определены участием разных белков мембран. В первом случае это  периферический белок спектрин. Во втором случае изменение проницаемости происходило за счет повреждения интегральных белков [16].  

Исследовали влияние времени увеличения температуры нагревания в диапазоне от 20° до 70°C. Время t(1/2), при котором достигался 50 % гемолиз при температуре экспозиции 53°C, было выбрано как критерий устойчивости эритроцитов к термогемолизу. Для интактных эритроцитов это время в среднем  составило 38 минут. При обработке веществ,  повышающих термостабильность, это время возросло до 62 минут. Установлено, что денатурация спектрина наблюдается при температуре 50°C, анионного обменника — при  67°C. Соединения, вызывающие увеличение термостабильности эритроцитов, по всей вероятности, вызывают преденатурационную перегруппировку копий анионного обменника, что и определяет резистентность к нагреванию [20].

Также установлено, что нагревание эритроцитов до 50° и 65°С приводило не только к снижению устойчивости, но  и изменению емкостного сопротивления красных клеток. Высказано мнение, что снижение устойчивости эритроцитов обусловлено денатурацией периферического белка спектрина. Изменение емкостного сопротивления обусловлено увеличением проницаемости для ионов за счет тепловой денатурации белка анионообменника. Предложено использовать данный метод для диагностики наследственно обусловленных изменений в мембранах эритроцитов [18].

На основании этих исследований Ivanov I. T. и соавт.  предложен  новый метод термического анализа импеданса эритроцитов. Он определяет три процесса в эритроцитарной мембране: падение мембранного потенциала при  температуре 49.5, активация пассивной проницаемости для PO(4)(2+) при 37°С и неорганических ионов при 61.5°C.  Процесс падения мембранного потенциала обусловлен денатурацией спектрина. Анионообменник вовлечен в более поздние процессы. Показано, что у больных мембранными дефектами эритроцитов падение мембранного потенциала и сферизация эритроцитов наблюдалась при 53°С. Этот метод обнаруживает мембранные дефекты, связанные с повреждением спектрина и анионообменного канала, и может быть использован при диагностике анемии, а также для дифференциальной диагностики анемий и гемоглобинопатий [17;19].

Föller  M. et. al. предпринята попытка выяснить молекулярный механизм развития анемии при гипертермии.  Показано, что увеличение температуры от 37° до 41° С стимулирует связывание аннексина V эритроцитов человека. Этот эффект сопровождается увеличением концентрации кальция в цитозоле, снижением внутриклеточной АТФ, сморщиванию клеток и экспозиции фосфатидилсерина на поверхности мембраны. Такие эритроциты  быстро удаляются из гемоциркуляции (eryptosis), что может привести к анемии при гипертермии [13].

Были проведены исследования термочувствительности эритроцитов при патологических состояниях. Так, в диапазоне температур 48-54°C определяли термочувствительность эритроцитов крови больных с синдромом Дауна. Установлено, что терморезистентность эритроцитов крови больных синдромом Дауна была в 1.6 раза выше таковой здоровых лиц [26].

Bochorishvili M. et al. [9] показано, что в термограммах цельной крови здоровых детей раннего возраста присутствуют три эндотерма (endotherms) при 60.5°C, 70°C and 80°C. В термограммах детей с пнемонией только один — при 70°C. Авторами предположено, что эндотерм при 60.5°C появляется вследствие денатурации альбумина, не связанного с жирными кислотами. Эндотермы при  70°C and 80°C обусловлены денатурацией эритроцитов. Авторами предложено использовать определение термограмм цельной крови для изучения нарушения обмена белков при пневмонии.

Как следует из  приведенных результатов, термоиндукция как  метод анализа физико-химических свойств и состояния мембран эритроцитов  является перспективной, особенно в аспекте доклинического скрининга препаратов, повышающих терморезистентность, а также при изучении механизмов развития патологических процессов и разработки новых диагностических процедур.

Рецензенты:

• Омарова И.М., д.м.н., зав. отделением химиотерапии Карагандинского областного онкологического диспансера, г. Караганда.
• Койчубеков Б.К., д.б.н., зав. кафедрой медицинской биофизики и информатики Карагандинского государственного медицинского университета, г. Караганда.

Работа получена 08.09.2011.

Библиографическая ссылка

Муравлёва Л.Е., Молотов-Лучанский В.Б., Клюев Д.А., Колесникова Е.А., Демидчик Л.А., Калина А.С. ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИЕ ПАРАМЕТРЫ ЭРИТРОЦИТОВ В УСЛОВИЯХ ТЕРМОИНДУКЦИИ. МИНИОБЗОР // Современные проблемы науки и образования. – 2011. – № 4.;
URL: https://science-education.ru/ru/article/view?id=4741 (дата обращения: 27.04.2020).

Источник