Анализ крови на пировиноградную кислоту

  Содержание пирувата в сыворотке крови в норме составляет 0,03—0,10 ммоль/л, или 0,3—0,9 мг/дл.

Пируват является одним из центральных метаболитов углеводного обмена. Он образуется в процессе распада глюкозы и гликогена в тканях, при окислении молочной кислоты, а также в результате превращений ряда аминокислот. Наиболее резкое повышение концентрации пирувата отмечается при мышечной работе и Вгвитаминной недостаточности. Кроме того, повышение содержания пирувата в крови отмечается при паренхиматозных заболеваниях печени, сахарном диабете, сердечной декомпенсации, токсикозах и других заболеваниях. В основном все факторы, вызывающие повышение содержания лактата, как правило, приводят и к увеличению концентрации пирувата в крови, поэтому лактат и пируват рекомендуется определять совместно.

D-3-Гидроксибугират в сыворотке

D-3-Гнлроксибутнрат в сыворотке в норме не определяется.

D-3-гидроксибутират — это бета-оксимасляная кислота, продукт обмена жирных кислот. Исследование D-3-гидроксибутирата в сыворотке имеет большое значение при сахар- ¦ом диабете. В основе патогенеза кетоацидоза и кетоацидотической комы у больных сахар- ¦ым диабетом лежит нарастающий дефицит инсулина. Вызванное дефицитом инсулина энергетическое клеточное голодание приводит к повышению активности гипоталамо-гипо- физарно-надпочечниковой системы, в результате чего увеличивается секреция гормонов, обладающих жиромобилизующим действием — СТГ, АКТГ, катехоламинов. При диабетическом кетоацидозе липолиз усиливается настолько, что кровь и печень буквально заполнены липидами. Метаболизм жирных кислот в печени в процессе глюконеогенеза приводит к образованию кетоновых тел, состоящих из ацетона (2 %), ацетоацетата — ацетоук- сусной кислоты (20 %) и D-3-гидроксибутирата (78 %). Уровень кетоновых тел повышается (кетоз), если их синтез превышает их распад. В норме утилизацию кетоновых тел осуществляют почки и мышцы. Непосредственными причинами кетоацидоза у больных сахарным диабетом являются: усиление распада НЭЖК в печени, нарушение ресистеза ацето- уксусной кислоты в высшие жирные кислоты, недостаточное окисление образовавшейся при распаде высших жирных кислот ацетоуксус ной кислоты в цикле Кребса, Накапливающиеся в тканях и в крови кетокислоты, кроме прямого токсического действия, вызывают ацидоз.

D-3-гидроксибутират является главным кетоновым телом в крови. При развитии кетоза уровень D-3-гидроксибутирата возрастает сильнее, чем уровень ацетона и ацетоацетата, тем самым D-3-гидроксибутират является более чувствительным маркером кетоза [Накамура Тэроу и др., 1995]. D-3-гидроксибутират, самое стабильное из кетоновых тел, может сохраняться в сыворотке до 7 дней при 4 °С. Ацетон и ацетоацетат менее стабильны, поэтому возможны большие ошибки при определении их концентрации в случае, если проведение анализа откладывается.

Наибольшее значение определение D-3-гидроксибутирата в сыворотке имеет у больных сахарным диабетом для выявления потенциально фатального кетоацидоза (особенно у больных с кетоацидотической диабетической комой). У больных сахарным диабетом с кетоацидотической диабетической комой падение уровня D-3-гидроксибутирата происходит на 2 ч раньше, чем падение уровня глюкозы после введения инсулина. Поэтому мониторинг D-3- гидроксибутирата у таких больных позволяет раньше обнаружить передозировку инсулина при внутривенной терапии, чем это можно сделать при определении уровня глюкозы в крови [Dawn В. et al., 1996]. Американская диабетическая ассоциация рекомендует определять D-3- гидроксибутират в крови у больных сахарным диабетом во время обострения заболевания, при стрессе, при беременности и если уровень глюкозы в крови стабильно превышает величину 13,4 ммоль/л.

У больных с тяжелыми травмами и заболеваниями, сепсисом, после обширных операций может быть выявлено увеличение содержания D-3-гидроксибутирата в сыворотке. Патогенез этих изменений обусловлен тем, что у таких больных голодание ведет к потере мышечной массы. Мышцы являются одним из мест утилизации кетоновых тел. Недостаточное поступление пиши у таких больных ведет к активации глюконеогенеза, т.е. синтезу глюкозы из белков и жирных кислот. Этот процесс сопровождается накоплением в крови кетоновых тел. Потеря мышечной массы приводит к тому, что мышцы перестают утилизировать кетоновые тела, и они накапливаются в крови. Выявление у таких больных повышенного содержания кетоновых тел в крови является показанием к проведению больному правильного парентерального и зондового питания. Мониторинг D-3-гидроксибутирата позволяет скорректировать парентеральное и зондовое питание.

Мониторинг D-3-гидроксибутирата в крови может быть полезен при наблюдении за реакцией пациентов на «голодную» диету. У голодающих людей механизм повышения D-3- гидроксибутирата в крови аналогичен вышеизложенному для тяжелобольных, однако у пациентов, находящихся на «голодной» диете, когда мышцы выключаются из процесса утилизации кетовых тел, эту функцию на 2—3-и сутки голодания берет на себя головной мозг, и уровень D-3-гидро ксибутирата в крови снижается. Поэтому если у пациента, находящегося на «голодной» диете, не происходит снижения уровня D-3-гидроксибутирата в крови, это является показанием к отмене такой диеты.

Регулярный мониторинг D-3-гидроксибутирата в крови полезен при коррекции кето- генной диеты у детей, больных эпилепсией, особенно с частыми приступами.

У больных с инсулиномой может быть выявлено повышенное содержание D-3-гидрок- сибутирата в крови, что позволяет заподозрить это заболевание. При инсулиноме вследствие снижения содержания глюкозы в крови активируются процессы глюконеогенеза. Идет усиленный синтез глюкозы в основном из жирных кислот, что приводит к накоплению кетоновых тел.

Определение кетоновых тел в крови является более точным, чем в моче, так как снижает риск получения ложноотрицательных результатов из-за низкой чувствительности и ложноположительных ответов из-за применяемых лекарств.

2,3-Дифосфоглицерат (2,3-ДФГ) в сыворотке

Содержание 2,3-ДФГ в сыворотке крови в норме составляет 1,6—2,6 ммоль/л.

Основная биохимическая роль 2,3-ДФГ — поддержание равновесия между восстановленным гемоглобином и оксигемоглобином в эритроцитах. Образуя с восстановленным гемоглобином комплекс, резистентный к оксигенации, 2,3-ДФГ снижает сродство гемоглобина к кислороду, облегчая тем самым его переход в ткани. Снижение pH крови (в эритроцитах) уменьшает сродство гемоглобина к кислороду и наряду с этим уменьшает концентрацию в эритроцитах 2,3-ДФГ, что позднее приводит к частичному увеличению сродства гемоглобина к кислороду. Исследование показано больным с дыхательной недостаточностью. При дыхательной недостаточности выявляется резкий подъем уровня 2,3-ДФГ, который сохраняется на протяжении всего течения заболевания. Имеется коррелятивная зависимость между степенью тяжести дыхательной недостаточности, выраженностью дыхательной гипоксемии и уровнем 2,3-ДФГ [Родионов В.В. и др., 1975]. Увеличение содержания 2,3-ДФГ способствует улучшению перфузии кислорода в ткани. Неблагоприятный исход дыхательной недостаточности сопровождается снижением 2,3-ДФГ иногда до крайне низких значений — в 2—2,5 раза ниже нормы.

Повышение содержания 2,3-ДФГ возможно при хронических заболеваниях легких, сердечной недостаточности с цианозом, некоторых видах анемий. 

Содержание ПВК увеличивается при гипоксических состояниях, вызвана тяжелой сердечно-сосудистой, легочной, кардиореспираторной недостаточно тью, анемиями; при злокачественных новообразованиях, остром гепатите (в поздних стадиях) и других заболеваниях печени (наиболее выражено в терминальных стадиях цирроза печени), токсикозах, инсулинзависимом сахарном диабете диабетическом кетоацидозе, дыхательном алкалозе (у детей), уремии, гепатоцеребральной дистрофии, гиперфункции гипофизарно-адреналовой и симпатико-адреналовой систем, а также после введения камфары, стрихнина, адреналина и при больших физических нагрузках (до 0,570 ммоль/л), тетании, судорогах (при эпилепсии).

К увеличению уровня ПВК приводят B1-витаминная недостаточность (бо­лезнь бери-бери), токсическое действие ацетилсалициловой кислоты (аспири­на), вызывающее при приеме в большой дозе метаболический ацидоз; отрав­ления ртутью, мышьяком, сурьмой.

Содержание ПВК в спинномозговой жидкости резко повышается при травматических заболеваниях ЦНС, воспалительных процессах — менингите, абсцессе мозга. Под влиянием наркоза содержание пировиноградной кислоты в крови несколько снижается.

Все факторы, обусловливающие увеличение концентрации ПВК, обычно приводят к возрастанию уровня молочной кислоты.

Работа №16 Методы определения гликозилированного гемоглобина

Поскольку здоровых людей содержание в биологических жидкости ациклической формы глюкозы невелико, концентрация в них неферментативно гликированных белков очень мала. Вместе с тем при стойком увеличении уровня глюкозы, галактозы и других моносахаридов в крови (наблюдаемом обычно при сахарном диабете, галактоземии) содержание гликозилированных белков значительно возрастает, нередко превышая верхнюю границу нормы в 2—3 раза.

Первый неферментативно гликозилированный белок, обнаруженный у человека, — гемоглобин A (HbAlc). HbAlc представляет собой продукт посттрансляционной неферментативной конденсации глюкозы и бета-цепей гемоглобина. Это гемоглобин взрослого человека (НЬАо), к аминогруппе концевой валина бета-цепи которого присоединен остаток глюкозы (лабильная форма HbAlc). После перегруппировки Амадори между белком и моносахаридом об­разуется кетоаминная связь, а остаток глюкозы превращается в остаток фрук­тозы (стабильная форма HbAlc). Помимо представленной в наибольшем количестве подфракции HbAlc выделяют еще подфракции HbAla и HbAlb.

HbAlc в отличие от нативного гемоглобина обладает повышенным сродс вом к кислороду, т.е. с трудом отдает доставленный к тканям кислород. При увеличении содержания HbAlc это приводит к гипоксии тканей. В ответ на хроническую гипоксию происходит стимуляция эритропоэза, увеличение в крови содержания суммарного гемоглобина и выброс в кровоток молодых форм эритроцитов (при диабете часто обнаруживают полицитемию).

Отмечена прямая корреляционная зависимость между уровнем глюкозы и со­держанием в крови гликозилированного гемоглобина. Концентрация гликозили­рованного гемоглобина в отличие от таковой глюкозы в крови не подвержена слу­чайным и суточным колебаниям. В связи с этим определение HbAlc находит все более широкое использование для постановки диагноза сахарного диабета.

В норме на долю HbAlc приходится 5,6—7,5% от общего содержания гемо­глобина.

Для обнаружения и количественного определения содержания гликозилированного гемоглобина используются методы хроматографического анализа электрофоретического фракционирования, абсорбционной фотометрии и некоторые другие.

Хроматографические методы дорогостоящи, длительны в исполнении и связаны с применением некоторых токсических реагентов, например раство­ров, содержащих цианид (!) калия.

Электрофоретические методы базируются на том, что электрический заряд молекулы HbAlc отличается от заряда молекулы негликозилированного гемо­глобина. В последние годы большой популярностью пользуются методы изоэлектрического фокусирования, электрофореза в полиакриламидном геле.

Разработаны и методы радиоиммунологического определения гликозили­рованного гемоглобина.

В клинико-лабораторной практике наиболее широко используются коло­риметрические методы определения HbAlc. Суть описанной Fluckiger и Winterhalter (1976) методики состоит в том, что гемолизат подвергают кислот­ному гидролизу с образованием 5-оксиметилфурфурола, который определяют спектрофотометрически по реакции с тиобарбитуровой кислотой. Это дает представление об уровне стабильной кетоаминовой формы HbAlc.

Фирмой «Лахема» выпускаются наборы реагентов «Гликозилированный гемоглобин» (GHb). Суть колориметрического метода, реализуемого с их помощью, состоит в том, что стабильная форма гликогемоглобина HbAlc, coдержащая 1-дезокси-1-(М-валил)фруктозу, дегидратируется фосфорной кислотой с образованием 5-оксиметил-2-фуральдегида, взаимодействующего с 2-тиобарбитуровой кислотой с формированием комплекса, обладающего максимумом абсорбции при 443 нм. Определению не мешает ни лабильная форма гликогемоглобина, ни ф тальный гемоглобин.

Параллельно с установлением уровня гликированного гемоглобина требуется определение содержания общего гемоглобина с применением соответс вующего набора реагентов.

Для установления содержания гликозилированного гемоглобина гемолизат с фосфорной кислотой вносят в пробирки, закрываемые резиновые пробками (типа тех, которыми закрываются флаконы с антибиотиками) с вколотой в них инъекционной иглой. Пробы нагревают 30 мин (на глицериновой бане) при 100°С. После 10 мин нагревания инъекционные иглы из пробок вынимают. По окончании дегидратации пробирки охлаждают в проточной воде или на ледяной бане в течение 10 мин, затем добавляют раствор трихлоруксусной кислоты. После встряхивания содержимое пробирок центрифугируют, от­бирают надосадочную жидкость, к которой добавляют раствор трихлоруксусной кислоты. После перемешивания пробу инкубируют 40 мин при 37°С в во­дяной бане. Измеряют оптическую плотность раствора и производят расчет по соответствующей формуле.

В состав набора входят: бутылочка с катионитной смолой, склянка с ли-зирующим раствором и 40 сепараторов. В начале хода определения готовят гемолизат, в стеклянные пробирки отмеряют 3 мл катионитной смолы, за­тем вносят гемолизат и в каждую пробирку помещают сепаратор. Содержи­мое пробирок встряхивают 5 мин, после чего сепаратор размещают так, что­бы смола оказалась тесно «спрессованной». Содержащийся вверху раствор переносят непосредственно в измерительную кювету.

Параллельно определяют содержание «полного гемоглобина», производят расчет результатов.

В норме на долю гликированного гемоглобина приходится 6,0—8,3%.

Фирмой «Реанал» предлагаются наборы реагентов (GHb), с помощью ко­торых реализуется видоизмененный метод Winterhalter.

Глюкозу, связанную с первичными аминогруппами, отщепляют кислотно-каталитической термообработкой в виде 5-гидрокси-метилфурфурола. Это со­единение, вступая в реакцию с тиобарбитуровой кислотой, дает окрашенный продукт, абсорбцию которого замеряют при длине волны 443 нм.

После добавления к гемолизированной крови серной кислоты и арсенита пробу подвергают термообработке в течение 1 ч. Затем к ней добавляют трях-лоруксусную кислоту и раствор фильтруют. В полученный фильтрат привносят тиобарбитуровую кислоту. Окрашенное соединение формируется в условия* прогревания (40°С) в течение 40 мин.

Для контроля качества фирмой «Реанал» предлагаются специальные контрольные сыворотки — «Гликогемоглобин» (нормального и патологичского ряда).

Для определения концентрации гемоглобина могут быть использованы наборы реагентов «Гемоглобин» («Био-Ла-Тест», «Лахема») и др., в основу которых положен гемоглобинцианидный метод исследования.

Клинико-диагностическое значение определения содержания гликированного гемоглобина.

Тест используется для диагностики сахарного диабета и наблю дения за состоянием углеводного обмена страдающих им больных. Классические следования Тривели с соавт. (1971) показали 2—3-кратное увеличение содержания гликозилированного гемоглобина у пациентов с диабетом по сравне­нию с уровнем его у здоровых людей. Определение уровня гликозилированно­го гемоглобина целесообразно проводить для постановки диагноза и контроля за лечением больных сахарным диабетом. Основные преимущества теста перед определением уровня глюкозы в сыворотке (плазме) крови следующие.

1. Если уровень глюкозы отражает гликемию на момент взятия материала для исследования, то уровень гликозилированного гемоглобина — за предшествующий длительный период циркуляции в крови гемоглобина.

2. Зависящая от особенностей питания, стрессовых воздействий и других факторов гипергликемия приводит к гипердиагностике сахарного диа­бета. Все эти влияния не сказываются на результатах определения гликозилированного гемоглобина.

3. Тест установления содержания гликозилированного гемоглобина более
специфичен для сахарного диабета, чем определение уровня глюкозы.

4. Метод определения HbAlc предусматривает удобные способы взятия, хранения и транспортировки проб крови для осуществления скрининга сахарного диабета.

При определении гликозилированного гемоглобина следует иметь в виду, что процедуре определения могут мешать гемолиз, состояние уремии, бере­менность.