Стандартизованная технология клинического лабораторного анализа крови

Повышение MSRV у спортсменов указывает на злоупотребление препаратами, стимулирующими эритропоэз.

LFR% (Low Fluorescence Ratio)- популяция малых зрелых RET (87-99%),

MFR% (Middle Fluorescence Ratio) — популяция средних RET (2-12%),

HFR% (High Fluorescence Ratio) (1-2%) – популяция больших незрелых RET.

MFR+HFR определяется как фракция незрелых ретикулоцитов — IRF (Immature Reticulocyte Fraction) (2-14%). Фракция незрелых ретикулоцитов может служить индикатором активности эритропоэза. Она повышается значительно раньше, чем процент ретикулоцитов и может служить наиболее чувствительным маркером в мониторинге за состоянием эритропоэтической активности костного мозга и эффективности лечения витамином В12, фолиевой кислотой препаратами железа и ЭПО. Появление незрелых ретикулоцитов в крови соответствует явлению полихромазии эритроцитов в окрашенном мазке крови

Ret-He (CHr) — содержание Hb в ретикулоцитах (норма 28,2 –32-36,4 пг ).

6.2. Тромбоцитарные параметры

PLT (platelet) — количество тромбоцитов (х109/л). В отличие от ручного подсчета тромбоцитов, где проводится предварительный лизис эритроцитов, автоматические счетчики крови анализируют тромбоциты и эритроциты без предварительной обработки. Это создает проблему дифференцирования больших форм тромбоцитов (макротромбоцитов) и сравнимых с ними по объему эритроцитов (микроцитов), их фрагментов (шизоцитов), а также фрагментов цитоплазмы лейкоцитов (клеточный дебрис). Для большинства современных гематологических анализаторов коэффициент вариации тромбоцитов не превышает 4-5%.

Таблица 10. Возможные ошибки измерения

При холодовой агглютинации или агрегации эритроцитов в исследуемом образце крови тромбоциты могут оказаться в них, что приводит к снижению количества PLT. Гипертромбоцитоз (более 1000х109/л) может превышать допустимый порог измерения PLT, что приведет к занижению показателя PLT. Это зависит от пределов линейности конкретного прибора. Гемолизированные образцы крови содержат строму эритроцитов, что обусловливает повышение показателей PLT. При взятии крови с использованием гепарина или цитрата натрия в качестве антикоагулянта отмечается более выраженная агрегация тромбоцитов, что результируется занижением значения PLT.

У некоторых пациентов может наблюдаться небольшая спонтанная агрегация тромбоцитов или реже, так называемая, К2ЭДТА-зависимая псевдотромбоцитопения (иммунного характера), причем эти явления прогрессируют по мере увеличения времени, прошедшего после взятия крови.

MPV (mean platelet volume) — средний объем тромбоцитов выражается в фемтолитрах (фл). В норме этот показатель варьирует от 7,4 до 10,4 фл. “Молодые” кровяные пластинки имеют больший объем, поэтому при ускорении тромбоцитопоэза средний объем тромбоцитов возрастает. В течение первых двух часов после взятия крови с К2ЭДТА происходит набухание тромбоцитов с изменением их объема и соответственно увеличением MPV. При наличии макротромбоцитов порог измерения для тромбоцитов может быть превышен и они не подсчитываются, что приводит к занижению MPV. Небольшие фрагменты эритроцитов и лейкоцитов могут препятствовать измерению MPV. Тромбоциты могут быть в агглютинатах эритроцитов, что приведет к ошибочным результатам MPV. Наличие агглютинатов в образце крови можно определить по аномальным значениям MCH и MCHC.

П р и м е ч а н и е 1 ─ Увеличение MPV наблюдается при идиопатической тромбоцитопенической пурпуре, гипертиреозе, атеросклерозе, сахарном диабете, у курильщиков и лиц, страдающих алкоголизмом. Крупные тромбоциты с аномальной морфологией появляются при миелопролиферативных заболеваниях.

Уменьшение этого показателя отмечается после спленэктомии и при синдроме Вискотта-Олдрича.

PDW (platelet distribution width), % — ширина распределения тромбоцитов по объему. Этот параметр определяется на основании гистограммы распределения тромбоцитов. PDW количественно отражает гетерогенность популяции этих клеток по размерам (степень анизоцитоза тромбоцитов). В норме этот показатель составляет 10-20%.

Увеличение PDW может быть признаком присутствия молодых тромбоцитов, агрегатов тромбоцитов, микроэритроцитов, фрагментов эритроцитов.

П р и м е ч а н и е 2 ─ PDW изменяется при миелопролиферативных заболеваниях.

PCT (platelet crit — тромбокрит), % — является параметром, который отражает долю объема цельной крови, занимаемую тромбоцитами. В норме тромбокрит составляет 0,15-0,40%.

IPF — (Immature Platelet Fraction) — фракция незрелых тромбоцитов. В норме составляет 1,0-10,3%.

Фракция незрелых тромбоцитов отражает состояние костномозгового тромбоцитопоэза.

Тромбоцитарная гистограмма. В норме тромбоцитарная кривая характеризуется унимодальностью и ассиметричностью. Гистограмма должна начинаться с базовой линии в области значений менее 2 фл и заканчиваться в зоне 20-30 фл.

Наличие в пробе патологических тромбоцитов (макро — или микро-), шизоцитов, микроэритроцитов, фрагментов лейкоцитов меняет форму тромбоцитарной гистограммы, что требует определенной корректировки получаемых результатов. Анизоцитоз тромбоцитов не влияет на результаты счета числа тромбоцитов. Множественные пики на тромоцитарной гистограмме могут наблюдаться при агрегации тромбоцитов, при этом результат подсчета тромбоцитов может быть ложно занижен. Для исключения ошибочного результата рекомендуется повторить исследование с цитратом натрия, который предотвращает свертывание крови в случае несовместимости образца с К2ЭДТА.

При выявлении патологической тромбоцитарной гистограммы следует анализировать окрашенный мазок крови.

6.3. Лейкоцитарные параметры

WBC (white blood cells) — количество лейкоцитов крови (х109/л). Измерение числа лейкоцитов проводится после полного лизиса эритроцитов специальным реактивом. Все частицы размером более 35 фл считаются как лейкоциты. Тромбоциты, размер которых меньше порогового значения 35 фл, исключаются из подсчета. Коэффициент вариации (CV) при автоматическом определении этого показателя составляет 2-3%.

При наличии резистентных к лизису эритроцитов они определяются как лейкоциты и вызывают повышение числа WBC. В этих случаях следует обратить внимание на изменение формы RBC гистограммы.

Таблица 11. Возможные ошибки измерения лейкоцитов

6.4. Подсчет лейкоцитарной формулы

Многие современные гематологические анализаторы определяют от 6 до 10 показателей лейкоцитарной формулы с учетом относительного и абсолютного количества клеток, так называемые 3Diff или 5Diff.

6.4.1 Гематологические анализаторы, определяющие 18 параметров крови, дифференцируют все WBC на три популяции (3Diff). В основе работы анализаторов 3Diff лежит принцип кондуктометрии. Клетки дифференцируются по объему на 3 категории: лимфоциты, нейтрофилы и средние клетки, состоящие преимущественно из моноцитов с добавлением эозинофилов и базофилов. Определяется как относительное (%),, так и абсолютное их содержание (клетки/л).

Автоматические гематологические анализаторы, определяющие 26 и более параметров крови, дифференцируют WBC на пять популяций (5Diff). В основе работы анализаторов 5Diff используется комбинация кондуктометрического метода с другими технологиями, такими как: метод лазерного светорассеивания, радиочастотный анализ, использование дифференцирующих лизатов, цитохимический метод.

Автоматический дифференцированный счет лейкоцитов должен выполняться в день взятия крови. Для получения наиболее точных результатов дифференциального анализа лейкоцитов рекомендуется исследование образцов крови проводить в промежуток времени от 30 минут до 5 часов после взятия материала, при значительном лейкоцитозе после предварительного разведения крови – от 5 минут до 1 часа.

После 24-часового интервала изменения, возникшие при хранении, могут воздействовать на систему «сигналы тревоги» и искажать результат. На дифференциальный счет популяций лейкоцитов влияют те же факторы, что и на общее число лейкоцитов. Появление «сигналов тревоги» указывает на наличие патологических изменений в исследуемом образце и требует микроскопического исследования окрашенного мазка крови.

6.4.2 Некоторые факторы, влияющие на дифференциальный счет лейкоцитов в гематологических анализаторах 3Diff

LY и LY%: микроформы бластов, нормобласты, резистентные к лизису эритроциты (например, эритроциты, содержащие малярийный плазмодий) могут быть причиной ошибочного измерения числа LY.

MO и MO%: крупные лимфоциты, атипичные лимфоциты, плазматические клетки, бластные клетки и избыточное количество базофилов могут оказывать влияние на точность подсчета МО. Часть эозинофилов также может просчитываться в данном канале.

GR и GR%: избыток эозинофилов, метамиелоцитов, промиелоцитов, бластных клеток и плазматических клеток могут быть причиной ошибочного подсчета GR и GR%.

На лейкоцитарной гистограмме в анализаторах 3Diff субпопуляции лейкоцитов попадают в три главные области гистограммы распределения WBC, которые отделены с помощью пороговых значений (дискриминаторов). Если результаты подсчета попадают в область нормальных значений, то никаких маркеров, предупреждающих о возможной патологии не появляется. Форма гистограммы изменяется при нарушении распределения лейкоцитов по популяциям или недостаточном лизисе эритроцитов.

Таким образом, гематологические анализаторы 3Diff в большинстве случаев позволяют выявлять изменения лейкоцитарной формулы крови, однако не способны проводить полную дифференцировку лейкоцитов. При наличии микроформ бластных клеток, по своему размеру сходных с лимфоцитами, анализаторы, принцип измерения которых основан только на кондуктометрическом методе, будут относить их к популяции мелких клеток (лимфоцитов).

6.4.3 В гематологических анализаторах 5Diff подсчитываются все 5 классов лейкоцитов, встречающихся в норме: нейтрофилы, лимфоциты, моноциты, эозинофилы и базофилы. Использование одновременно нескольких методов анализа позволяет значительно улучшить качество дифференцировки клеток и, следовательно, работу анализатора. В анализаторах данного типа более сложная система «сигналов тревоги», позволяющая уточнить наличие патологических клеток (незрелых нейтрофилов, атипичных лимфоцитов, бластных клеток, нормобластов). При плохом качестве материала анализаторы выдают дополнительные «сигналы тревоги», такие, например, как сгустки тромбоцитов, фрагменты эритроцитов-призраков. Они снабжены соответствующими программами обнаружения незрелых клеток, активированных лимфоцитов, бластных клеток.

Обозначения флагов дифференциальных параметров зависят от фирмы-производителя анализатора.

Это могут быть: LIC (Large Immature Cells), которые, в свою очередь, подразделяются на:

— IMG (Immature Granulocytes), незрелые гранулоциты,

— IMM (Immature Monocytes) незрелые моноциты,

— IML (Immature Lymphocytes) незрелые лимфоциты,

— LS (Left Shift) – левый сдвиг, указывающий на возможность левого сдвига в формуле крови (палочкоядерные нейтрофилы)

При наличии более 2,5% LIC рекомендовано микроскопическое

исследование мазка крови.

При лимфоцитозах или наличии измененных по объему лимфоцитов появляются следующие флаги:

— Аtipical Lymphocytes, Variant

— Lymphocytes, Reactive

— Lymphocytes, Abnormal Lymphocytes

Большинство гематологических анализаторов 5Diff имеют жесткую систему как внутреннего, так и внешнего контроля качества, что делает их работу более надежной.

Несмотря на все достоинства, даже самые современные гематологические анализаторы обладают некоторыми ограничениями, которые касаются точной морфологической оценки патологических клеток (например, при лейкозах), и не в состоянии полностью заменить световую микроскопию.

7.  Контроль качества исследования клеточного состава крови на автоматических гематологических анализаторах

7.1.  Порядок проведения контроля качества

Комплексная система контроля качества клинических лабораторных исследований осуществляется путем:

— установления единых требований к аналитическому качеству количественных методов;

— ежесерийного выполнения процедур внутрилабораторного контроля качества с использованием контрольных материалов (оперативный контроль качества);

— регулярного участия в программах внешней оценки качества (ГОСТ Р 53133.1―2008) [4].

Внутрилабораторный контроль качества представляет собой систему повседневного слежения за точностью получаемых на гематологическом анализаторе результатов для поддержания стабильности аналитической системы, выявления и устранения недопустимых случайных и систематических погрешностей и заключается в сопоставлении результатов исследования проб с результатами исследования контрольного материала и измерении величины отклонения.

Проводится в соответствии с инструкцией к прибору и инструкцией к используемым контрольным материалам и требованиями стандарта ГОСТ Р 53133.2―2008 [5]..

Внутрилабораторный контроль качества должен быть:

— систематическим, повседневным, проводиться по единым правилам, т. е. анализ контрольных проб должен включаться в обычный ход работы лаборатории;

— охватывать все области измерений (норма, высокие и низкие патологические значения);

— производиться в реальных условиях работы лаборатории (так же, как обычные пробы пациентов, т. е. тем же персоналом и в тех же условиях);

— объективным (желательно «шифровать» контрольный материал, чтобы исполнитель не знал, где опыт, а где контроль).

Принцип проведения внутреннего контроля достаточно прост: периодически (в каждой серии) нужно проводить измерение одного и того же контрольного материала, а результаты этих измерений заносить на контрольную карту.

Хорошо организованная система внутреннего контроля качества позволяет достаточно эффективно выявлять ошибки, связанные с:

l  внешними варьирующими факторами (реактивы, калибраторы, расходные материалы);

l  внутренними варьирующими факторами (организация в лаборатории «домашних реактивов», обучение персонала, обслуживание приборов, ведение документации, реакция персонала на возникающие проблемы).

Концентрация гемоглобина в большинстве гематологических анализаторов определяется фотометрически. Различное влияние липидемии на определение гемоглобина связано с техническими особенностями прибора. Величина результирующей ошибки зависит от оптической геометрии прибора: размера выходного отверстия из кюветы для образцов и расстояния до фотодиода.

Контролем за правильностью измерения концентрации гемоглобина может служить величина МСНС. Чаще всего увеличение МСНС свидетельствует об ошибках, допущенных при измерении пробы (погрешности определения гемоглобина или MCV). В подобных ситуациях наиболее точные результаты определения концентрации гемоглобина гемиглобинцианидным методом могут быть получены на фотометре при добавлении в холостую пробу 20 мкл сыворотки больного. Таким образом, данный параметр может быть использован и как индикатор ошибок, допущенных на аналитическом или преаналитическом этапах работы.

7.2.  Требования к качеству исследований клеточного состава крови

Для оценки качества исследований рассчитываются следующие статистические

показатели:

— среднее арифметическое значение или средняя арифметическая (Х ):

— предварительная оценка прецизионности (по 10 измерениям в одной серии) — CV10;

— предварительная оценка относительного смещения – В10;

— окончательная оценка прецизионности (по 20 измерениям) CV20;

— окончательная оценка относительного смещения В20.

В таблице 11 представлены рекомендуемые стандартом ГОСТ Р 53133.1─2008 (приложение А) оперативные пределы допускаемых значений внутрилабораторных погрешностей гематологических исследований. Эти ПДЗ вычислены как компромисс между основанными на коэффициентах биологической вариации пределами погрешностей и фактическими характеристиками точности, достигнутыми большей частью клинико-диагностических лабораторий страны по данным системы внешней оценки качества.

Таблица 12

Оперативные пределы допускаемых значений

В таблице 13 представлены ПДЗ, рассчитанные на основе имеющихся в литературе данных о биологической вариации. Их можно рассматривать как желательные нормативы.

Таблица 13

Оперативные пределы допускаемых значений, рассчитанные на основе данных о биологической вариации

7.3 Критерии действий после выполнения автоматизированного общего анализа крови и дифференциального анализа лейкоцитов