Риа анализ крови что это такое
Радиоиммунологический метод (РИА; син. радиоиммунологический анализ) — основанный на реакции антиген—антитело метод количественного определения биологически активных соединений, обладающих антигенными свойствами, и антигенов микроорганизмов с помощью аналогичных известных антигенов или антител, меченных радиоактивным изотопом. Радиоиммунологический метод позволяет количественно определять в жидкостях организма (сыворотка крови, моча и др.) содержание гормонов и различных антигенов, в т. ч. антигенов микроорганизмов. Основным достоинством Радиоиммунологического метода является его очень высокая чувствительность благодаря использованию изотопной метки антигенов (или антител) и применения сывороток с высоким сродством и специфичностью антител (см.).
Становление и развитие Радиоиммунологического метода связано с работой Ялоу и Берсона (R. S. Yalow, S. A. Berson, I960), предложивших этот метод для определения эндогенного инсулина в плазме крови.
Сущность Р. м. состоит в использовании для определения антигенов (см.) соответствующих иммунных сывороток и введении в систему антиген — антитело антигена, меченного радиоактивным изотопом, напр, йода (125I), в результате чего происходит связывание определяемого (немеченого) и меченого антигена с ограниченным количеством антител. Т. к. меченый антиген добавляется в определенной дозе, то можно определить, какая его часть связалась с антителами, а какая часть осталась несвязанной в результате конкуренции с выявляемым немеченым антигеном. При определенных концентрациях количество меченого антигена, связавшегося с антителами, обратно пропорционально количеству определяемого антигена. Схематически этот процесс можно изобразить следующим образом:
После взаимодействия антигенов с антителами образовавшиеся комплексы антиген—антитело (см. Антиген-антитело реакция) отделяют от свободного меченого антигена. Отделение комплекса антиген—антитело производят различными способами: с помощью электрофореза (см.), гель-фильтрации (см.), фракционного осаждения иммунного комплекса этанолом, сульфатом аммония и др., а также с помощью агрегации иммунных комплексов антиглобулиновой сывороткой или сорбции их на иммобилизованных (прикрепленных к поверхности твердой фазы) антителах. Кроме этого, возможна сорбция свободного меченого антигена с помощью добавленных веществ, напр, талька, целлюлозы, кварца, активированного угля и др. Отделив меченый несвязанный антиген от комплекса антиген— антитело, определяют количество меченого антигена, связавшегося в комплексе но количеству импульсов (с помощью сцинтилляционного счетчика). Снижение количества импульсов в единицу времени в сравнении с соответствующими контролями свидетельствует о присутствии гомологичного меченого антигена, связанного с анти-сывороткой, в результате чего меченый антиген не вступил в реакцию и не определяется в комплексе антиген— антитело.
Иммунную сыворотку против определяемого антигена и меченого антигена предварительно оттитровывают и используют в Р. м. в оптимальном разведении, при к-ром происходит связывание 50% внесенной метки. Для оценки результатов применяют данные (график) зависимости связывания меченого антигена сывороткой в оптимальном разведении от концентрации меченого (стандартного) антигена.
Широко применяются в Р. м. антитела сыворотки против антигена, иммобилизованные (адсорби рованные) на поверхности пластика или химически связанные с поверхностью полимера. В 1966 г. Кетт (K. J. Catt) с группой исследователей, а также Уайд и Порат (L. Wide, J. P. Porath) применили в Р. м. иммобилизацию антител на полимере. Была показана возможность иммобилизации антител на сефадексе и целлюлозе, обработанных бромцианом, а также на различных пластмассах без предварительной обработки активатором. Для проведения реакции в полистироловые пробирки с иммобилизованными на внутренней поверхности антителами вносят определяемый антиген. После инкубации несвязанный антиген удаляют промыванием и вносят меченый антиген, который затем удаляют таким же образом, определяя в дальнейшем долю связанной радиоактивной метки.
Существует разновидность Р. м.— метод двойной системы антител, когда комплекс антиген—антитело обрабатывается антиглобулиновой преципитирующей сывороткой (вторые антитела) с последующим отделением преципитата центрифугированием. Добавление вместе с антиглобулиновой сывороткой нормальной сыворотки крови того же животного. от к-рого получены первые антитела, способствует преципитации комплексов.
Определение антигена с помощью меченых антител получило название иммунорадиометрического метода. В этом случае антиген предварительно фиксируют на твердой фазе, напр, в полистироловых пробирках. При постановке реакции определяемый антиген образует комплекс с мечеными антителами, который остается в растворе, а не прореагировавшие антитела взаимодействуют с антигеном, прикрепленным к твердой фазе. В варианте иммунорадиометрического метода — методе двойного связывания — определяемый антиген образует комплекс с антителами, иммобилизованными на твердой фазе. Затем после удаления свободного антигена промыванием поверхности твердой фазы добавляются меченые антитела, выявляющие комплекс. Радиоактивность комплекса антитело — антиген — антитело — 125I сравнивается с радиоактивностью контрольных проб, проб, заведомо содержащих и не содержащих антиген.
Высокая чувствительность Радиоиммунологического метода (до пикограмм определяемого вещества) позволила более точно определить концентрацию многих биологически активных соединений. К недостаткам Р. м. относят возможное снижение специфичности за счет посторонних примесей в определяемом образце, напр, некоторых лекарств, и наличие в сыворотке крови перекрестно реагирующих антител. Кроме того, у антигенов и антител, меченных гамма-излучающими изотопами, короткий срок хранения; при работе с ними следует соблюдать особые меры безопасности. В этом отношении существует менее опасный метод, сходный по принципу с Р. м., в к-ром применяются антигены или антитела, меченные ферментом (см. Энзим-иммунологический метод). Широкое внедрение Р. м. затруднено из-за трудности получения стандартных меченых сывороток и антигенов, необходимости соблюдать правила работы с радиоактивными веществами, применять дорогостоящее оборудование (гамма- и бета-счетчики, камеры глубокого охлаждения, компьютеры и др.) и реактивы с высоким требованием к чистоте стандартов, а также высокоспецифические сыворотки.
См. также Радиоизотопное исследование.
Библиография: Иммунологические методы исследования в клинике и эксперименте, под ред. А. Я. Лысенко, М., 1978; Иммунологические методы, под ред. X. Фримеля, пер. с нем., М., 1979; Чард Т. Радиоиммунологические методы, пер. с англ., М., 1981, библиогр.; Yаlоw R. S. a. Berson S. A. Immunoassay of endogenous plasma insulin in man, J. clin. Invest., v. 39, p. 1157, 1960.
А. С. Быков.
Источник: Большая Медицинская Энциклопедия (БМЭ), под редакцией Петровского Б.В., 3-е издание
Рекомендуемые статьи
Источник
В 1956 г. они впервые обнаружили у больных, леченных инсулином, непреципитирующие антитела, способные связывать 131I-инсулин. Затем эта научная группа показала, что немеченый инсулин конкурирует с меченым за связывание с антителами и вытесняет его из иммунных комплексов. Впоследствии Berson и Yalow разработали первый метод РИА для измерения концентрации инсулина в сыворотке, за что они были удостоены Нобелевской премии. В этом методе инсулин, связанный с антителами, отделяли от несвязанного инсулина путем электрофореза на бумаге. Примерно в то же время, в 1960-х гг., Grodsky и Forsham описали сходный метод РИА с использованием 131I-инсулина, но для разделения связанного и несвязанного гормонов они вместо электрофореза применяли высаливание.
Огромный вклад в развитие РИА внесли Hales и Randle в 1963 г. Для разделения связанного и несвязанного гормонов они применили антитела против у-глобулинов, так называемые вторичные антитела. Этот подход основывался на результатах работ Skom и Talmadge, которые в 1958 г. показали, что вторичные антитела вызывают преципитацию комплексов «антиген—первичное антитело». Метод Hales и Randle, получивший название «метода двойных антител», оказался значительно более чувствительным и специфичным, чем прежние варианты РИА.
В 1963 г. Herbert et al. разработали методику отделения комплексов «антиген—антитело» от несвязанного антигена при помощи активированного угля, покрытого декстраном. В основе методики лежит свойство угольно-декстрановой смеси практически мгновенно абсорбировать свободный антиген, не связывая при этом комплексы антиген-антитело. Эта методика позволяет отделять иммунные комплексы гораздо быст7 рее, чем преципитационные методики, поэтому в ней можно использовать 131I-антигены с низкой удельной активностью, меченные по Hunter и Greenwood.
В то же самое время Utiger et al. расширили область применения РИА, разработав способ количественного определения человеческого СТГ. Позднее Greenwood et al. внедрили методику йодирования СТГ, позволяющую получать меченый гормон с удельной активностью 200— 500 мКи/мг (6000-9000 Ки/ммоль).
Эта методика используется и поныне. Суть ее заключается в том, что изотоп йода (1311 или 1251) в составе йодида натрия окисляется хлорамином Т и в таком виде замещает один или несколько атомов водорода в фенольном кольце тирозина и в имидазольном кольце гистидина. Через 1 мин к реакционной смеси добавляют восстановитель, чтобы избежать излишнего повреждения гормона. Отметим, что принцип окислительного йодирования белков был описан Hughes еще в 1957 г. В дальнейшем Meyer и Knobil разработали РИА для измерения человеческого и обезьяньего СТГ, в котором для отделения несвязанного гормона применялся активированный уголь.
Первый РИА для измерения уровня гонадотропных гормонов (в данном случае — ЛГ), разработанный в 1966 г., основывался на использовании антител к человеческому ХГ, поскольку ранее было показано, что эти антитела связываются и с человеческим ЛГ. Один из экспериментов в этой области произвел настоящую революцию в иммунохимии: Catt et al. обнаружили, что антитела способны прилипать к дискам из диазотированного полистирола. Таким образом, отпала необходимость в отделении комплексов антиген—антитело с помощью преципитации или абсорбции. Позднее Catt et al. научились иммобилизировать антитела непосредственно на ненасыщенном полистироле в щелочной среде. Результаты этих работ послужили основой для создания ИФА (см. ниже). Faiman и Ryan впервые сумели получить антисыворотку к гипофизарному гонадотропину — человеческому ЛГ. В дальнейшем были разработаны РИА для определения крысиного ЛГ.
Разработка РИА для измерения уровня ФСГ, как и в случае с ЛГ, начиналась с прицелом на будущие клинические исследования. В 1967 и 1968 гг. несколько научных групп сообщили о новых методах РИА для разных форм человеческого ФСГ. Все они были основаны на методе двойных антител.
В 1967 г. Aria и Lee впервые объявили о способе определения пролактина, основанного на методе двойных антител. Первые измерения уровня пролактина методом РИА были проведены, за отсутствием человеческого материала, в овечьей и бычьей плазме.
Теоретические основы РИА
Первые методы РИА (например, методы Berson и Yalow или Grodsky и Forsham) были основаны на феномене конкурентного ингибирования. Этот феномен заключается в том, что связывание меченого изотопом гормона (меченого антигена) со специфическими антителами подавляется в присутствии немеченого гормона (немеченого антигена). Феномен конкурентного ингибирования можно описать двумя уравнениями: «меченый антиген + антитело меченый комплекс» и «немеченый антиген + антитело <-> немеченый комплекс». Таким образом, число молекул меченого гормона, входящих в состав комплексов антиген—антитело, обратно пропорционально исходному числу молекул немеченого гормона в реакционной смеси. Иначе говоря, радиоактивность комплексов, отделенных от несвязавшихся антител и антигенов, будет тем выше, чем ниже была концентрация немеченого гормона.
Обычно РИА проводят при температуре 4 или 37°С в фосфатно-солевом буферном растворе при рН 7 или 8. Реакция может длиться от 2 до 24 ч (в зависимости от аффинности антител и желаемого уровня чувствительности). Отметим, что автоматизация анализа и усовершенствование способов получения антител значительно сократили время реакции. Когда в реакционной смеси устанавливается равновесие, комплексы антиген—антитело отделяют преципитацией с помощью вторичных антител, абсорбцией свободных антигенов и антител на активированном угле, или осаждением в среде с высокой плотностью, например в среде с полиэтиленгликолем. Если же это твердофазный РИА, то инкубационную среду просто удаляют, а комплексы антиген—антитело остаются на полистироле или другой твердой фазе. На последнем этапе измеряют радиоактивность комплексов. Если гормон был помечен 125I или 131I, используют счетчик у-излучения, если меткой служил 3Н, используют сцинтилляционный счетчик β-частиц. Концентрации гормона в пробах рассчитывают по калибровочной кривой, построенной по результатам измерений в стандартных образцах с известными концентрациями гормона.
Получение антител
Поликлональные антитела для РИА получают путем иммунизации антигеном (гормоном) животных разных видов, в том числе кроликов, кур, морских свинок, уток, коз и овец. Для получения первичных антител (против гормона) обычно используют кроликов и морских свинок, для получения вторичных антител (против первичных) — овец и коз.
Существует множество методов иммунизации, самый распространенный — инъекция антигена в подушечку лапы, или в регионарный лимфоузел, или в селезенку. Так как в организме хозяина антигены существуют очень недолго, для надежной индукции иммунного ответа используют адъювант Фрейнда. Неиммуногенные антигены с небольшой молекулярной массой (например, стероидные гормоны) и антигены с низкой иммуногенностью перед иммунизацией присоединяют к крупным молекулам или частицам (метилированному альбумину, ферритину, декстрану, сефадексу и т. п.). Обычно иммунизацию проводят в несколько этапов с интервалами в 2 недели. Как правило, после нескольких инъекций титр антител в сыворотке быстро растет. Кровь для получения иммунной сыворотки берут из полостей сердца или из вен и артерий уха. Последний способ чаще всего применяют у кроликов. Полученную сыворотку инкубируют 30 мин при 57°С для разрушения комплемента. Затем к сыворотке добавляют консервант, предотвращающий рост бактерий и грибов (азид натрия или тиомерсал).
Моноклональные антитела
В 1975 г. Kohler и Milstein разработали принципиально новую — гибридомную — технологию получения антител. Позже эта разработка была отмечена Нобелевской премией. Опишем основные элементы этой технологии.
Мышей или крыс иммунизируют антигеном, например гормоном. Когда титр антител в сыворотке становится достаточно высоким, у иммунных животных из селе зенки выделяют плазматические клетки среди которых есть и клетки — продуценты антител к исходному антигену. Плазматические клетки гибридизуют in vitro клетками миеломы, происходящими о животных того же вида. Затем клеточную суспензию переносят в селективную среду, в которой выживают только гибридные клетки, а плазматические и миелом ные клетки погибают. Гибридные клети по одной рассевают в лунки с питатель ной средой, где они делятся и образую гибридомы (бессмертные клеточные линии). Среди множества гибридом отбирают те, которые продуцируют антитела нужному антигену, и размножают их питательной среде либо в брюшной полости сингенных мышей. Из питательно; среды или асцитической жидкости выделяют антитела. Эти антитела называют моноклональными, поскольку они продуцируются гибридомой, являющейся потомком одной-единственной плазматической клетки. Моноклональные антитела, вырабатываемые одной гибридомой, распознают только одну детерминанту какого-либо антигена. В этом и состоит принципиальное отличие моноклональных антител от поликлональной антисыворотки, в которой обычно содержится несколько разных антител к различным детерминантам одного антигена.
Одно из важных преимуществ моноклональных антител перед поликлональными заключается в том, что один и тот же вид моноклональных антител с определенной специфичностью и аффинностью можно получать в любых количествах и практически бесконечно (поскольку гибридома бессмертна). Напротив, антительный состав поликлональных антисывороток весьма изменчив, что требует проверки каждой новой партии антисыворотки и подбора условий ее применения. Таким образом, использование моноклональных антител существенно облегчает стандартизацию РИА и других иммунохимических методов анализа.
Получение гормонов, меченных радиоактивными изотопами
Как уже говорилось, для йодирования белковых гормонов чаще всего применяют метод, предложенный Greenwood и Hunter. Изначально в качестве метки использовали 131I, но из-за короткого периода полураспада этого изотопа (8 сут) срок годности меченого гормона был невелик. В 1967 г. Wilde et al. применили для йодирования 125I (Т1/2 = 60 сут). С тех пор этот изотоп применяется для мечения любых белковых и некоторых небелковых гормонов. При этом получаются меченые гормоны с удельной активностью 100—250 мКи/мг. Этого вполне достаточно для надежной регистрации излучения на счетчике ϒ-частиц.
Для мечения небелковых гормонов используют и другие радиоактивные изотопы, такие как излучатели β-частиц 3H или 14C. Меченные 3H или 14C стероиды применяют не только в иммунохимическом анализе гормонов, но и в фундаментальных эндокринологических исследованиях, например для изучения локализации рецепторов стероидов в разных клетках и тканях экспериментальных животных.
Источник
В качестве метки используются радиактивные изотопы (131I, 125 I, или 3 H и 14 C).
В зависимости от техники постановки выделяют два способа РИА:
1) техника «жидкая фаза» (классический РИА).
Недостаток этой техники постановки – необходимость специального разделения свободного и связанного меченного антигенов (или антител).
2)техника «твёрдая фаза»
АГ или АТ известной специфичности связываются на сорбентах (твёрдой фазе) – стенках полистироловой лунке или пластиковой пробирки. На иммобилизованный АГ (АТ) последовательно сорбируются остальные компоненты ИК.
В зависимости от характера реакции различают следующие методы:
1) Конкурентный метод – метод, основанный на конкуренции антигенов (определяемого и меченного) за присоединение с адсорбированными на сорбенте антителами или антител (определяемого и меченного) за присоединение с адсорбированными на сорбенте антигенами.
Компоненты реакции:
а) определяемый АГ (исследуемый материал – кровь, мокрота и др.) или АТ (сыворотка крови);
б) идентичный к исследуемому АГ-у антиген или исследуемому АТ-у антитело, меченые радиоизотопом;
в) специфические АТ-ла или АГ-ны известной концентрации, связанные на сорбенте;
г) стандартный АГ или АТ (контрольный);
д) буферный раствор.
Сначала в реакцию вводят исследуемый АГ (или АТ). Происходит образование комплекса АГ-АТ на поверхности сорбента. Сорбент отмывают, затем вводят меченый АГ (или АТ). Чем больше содержание исследуемого АГ (или АТ), тем меньше меченного АГ (или АТ) связывается с АТ-м (АГ-м) на поверхности сорбента. Концентрацию меченного АГ (или АТ) определяют измерением радиоактивности реакции с помощью счетчиков. Величина радиоактивности реакции будет обратно пропорциональной количеству АГ (АТ) в исследуемой пробе.
2) Неконкурентный метод.
Компоненты реакции:
а) определяемый АГ;
б) специфические АТ-а известной концентрации, связанные на сорбенте;
в) идентичные к связанному антителу антитела, меченые радиоизотопом;
г) стандартный АГ;
д) буферный раствор.
К связанным АТ добавляют исследуемый АГ. В процессе инкубации на сорбенте образуются комплексы АГ-АТ. Сорбент отмывают от свободных компонентов и добавляют меченые АТ, которые связываются со свободными валентностями АГ-на в составе комплекса. Величина радиоактивности пропорциональна концентрации исследуемого АГ.
3) «Сэндвич-метод» (непрямой метод) – наиболее распространённый метод.
Компоненты:
а) исследуемая сыворотка (или исследуемый АГ);
б) АГ-ы, связанные на сорбенте (или АТ-ла, связанные на сорбенте при определении АГ).
в) диагностические АТ против иммуноглобулинов, меченные радиоизотопами;
г) контрольные сыворотки (или АГ-ы)
д) буферные растворы
Исследуемые АТ-а (или АГ-ы) реагируют с твёрдофазными АГ-ми (АТ-ми), после чего инкубат удаляется и в реакцию вводят меченые антиглобулиновые АТ, которые связываются со специфическими комплексами АГ- АТ на поверхности сорбента. Величина радиоактивности реакции прямо пропорциональна количеству исследуемого АТ (или АГ).
Достоинства РИА:
1) высокая специфичность и чувствительность
2) простота техники постановки
3) точность количественной оценки результатов.
4) легко поддаётся автоматизации
Недостаток: использование радиоактивных изотопов.
Иммуноферментный анализ (ИФА)
В качестве метки используются ферменты: пероксидаза, щелочная фосфатаза и др.
Индикатором реакции является способность ферментов вызывать цветные реакции при действии на соответствующий субстрат. Например, субстратом для пероксидазы является раствор ортофенилдиамина.
Наиболее широко применяется твердофазный ИФА (см. прилож.3, рис.11 и 12).
Сущность ИФА аналогична РИА.
Результаты ИФА можно оценить визуально и измерением оптической плотности на спектрофотометре.
К преимуществам ИФА следует отнести:
— отсутствие контакта с радиоактивными веществами;
— простота методов оценки реакции;
— стабильность конъюгатов;
— легко поддаётся автоматизации.
Однако по сравнению с РИА отмечают более низкую чувствительность метода, но в некоторых случаях чувствительность превосходит РИФ и РИМ.
В качестве примеров приводятся следующие типы ИФА:
Конкурентный тип.
Предназначен для выявления поверхностного антигена вируса гепатита В (HBs Ag) в сыворотках и плазме крови при диагностики вирусного гепатита В и определение носительства HBs Ag.
Компоненты:
1) исследуемый материал – сыворотка или плазма крови;
2) антитела к HBs Ag, адсорбированные на поверхности лунки полистиролого микропланшета;
3) конъюгат – мышиные моноклониальные антитела к HBs Ag, меченые пероксидазой
4) ортофенилендиамин (ОФД) – субстрат
5) фосфатно – солевой буфер
6) контрольные сыворотки:
— положительная (сыворотка с HBs Ag)
— отрицательная (сыворотка без HBs Ag).
Ход работы.
1) Внесение контрольных и исследуемых сывороток.
2) Инкубация 1 час при 370 С
3) Отмывание лунок.
4) Внесение конъюгата
5) Инкубация 1 час при 370 С
6) Отмывание лунок.
7) Внесение ОФД. При наличии HBs Ag раствор в лунках желтеет.
Учёт ИФА проводят по оптической плотности с помощью фотометра. Степень оптической плотности будет обратно пропорциональной концентрации исследуемых HBs Ag.
Механизм.
Реакция протекает в три фазы:
1) HBs Ag исследуемой сыворотки (плазмы) связывается с гомологичными АТ, адсорбированными на поверхности лунки. Образуется ИК АГ — АТ. (HBs Ag – anti HBs АТ).
2) Антитела к HBs Ag, меченые пероксидазой связываются с оставшимися свободными детерминантоми HBs Ag комплекса АГ-АТ. Образуется комплекс АТ-АГ-меченые АТ (anti HBs АТ-HBs Ag-anti HBs АТ, меченые пероксидазой).
3) ОФД взаимодействуют с пероксидазой комплекса АТ-АГ-АТ и происходит жёлтое окрашивание.
Непрямой тип.
Является основной тестовой реакцией диагностики ВИЧ – инфекции.
Цель: Серологическая диагностика ВИЧ-инфекции – обнаружение антител к антигенам ВИЧ.
Компоненты:
1) исследуемый материал – сыворотка крови (АТ к АГ-м ВИЧ)
2) синтетические пептиды имитирующие 2-х антигенов ВИЧ: gp 120 и gр 41, адсорбированные на поверхности полистироловой лунки
3) антиглобулиновая сыворотка, меченная пероксидазой, полученная путём иммунизации кроликов глобулинами человека (АТ к АТ-м).
4) ОФД
5) фосфатно-солевой буфер
6) контрольные сыворотки:
— положительная
— отрицательная
Ход работы.
1) Внесение контрольных и исследуемых сывороток
2) Инкубация 30 минут при 370 С
3) Отмывание
4) Внесение антиглобулиновой сыворотки меченой ферментом
5) Инкубация 30 минут при 370 С
6) Отмывание
7) Внесение ОФД
Механизм.
Реакция протекает в 3 фазы:
1) Антитела к ВИЧ исследуемой сыворотки связываются с гомологичными антигенами (gр 120 и gр 41), и на поверхности сорбента образуется ИК АГ-АТ ( АГ ВИЧ — АТ к ВИЧ)
2) Образование ИК АГ-АТ-АТ, меченое пероксидазой, т.к. АТ исследуемой сыворотки являются антигенами для антиглобулиновой сыворотки
3) ОФД взаимодействует с пероксидазой комплекса АГ-АТ-АТ, и происходит жёлтое окрашивание раствора лунки. Степень ферментативной активности прямо пропорциональна концентрации исследуемых АТ.
Рекомендуемые страницы:
Воспользуйтесь поиском по сайту:
Источник
