Радиоиммунный анализ крови что это
Современная медицина обладает методами специфического диагностирования, которые дают возможность устанавливать этиологию заболеваний у людей на основании определения возбудителя, генетически чужеродных веществ, что стимулируют иммунную реакцию, нуклеиновых кислот, а также сдвигов аллергического и иммунного характера, которые происходят из-за его действия. Сегодня в иммунологии и вирусологии широко применяется РИА, то есть радиоиммунный анализ, цели постановки, компоненты, ход, учеткоторого, мы рассмотрим в данной статье. Этот анализ способен определять антигены в результате их взаимодействия с антителами.
Определение
РИА представляет собой такой метод диагностирования биологически активных веществ в жидкостях, в основе которого лежат реакции антигенов с антителами при применении меченых радионуклидами аналогичных им веществ, которые имеют особые системы связывания. После их взаимодействия образуется иммунный комплекс, который отделяют и изучают его радиоактивность. Известно, что радиоиммунный анализ проводится при помощи стандартных наборов реагентов.
Каждый реагент способен определить концентрацию одного конкретного вещества. Биологическая жидкость, взятая у человека, смешивается с реагентом, по прошествии периода инкубации происходит разделение свободного и связанного радиоактивного вещества, далее проводится радиометрия и расчет результатов. Для метки веществ применяют изотоп йода. Его метят и добавляют в определенном количестве.
Применение
Радиоиммунный анализ применение имеет широкое в медицине и микробиологии. С его помощью проводится диагностика сердечных и сосудистых заболеваний, болезней эндокринной и иных систем организма. Также часто РИА используются для выявления причины бесплодия, патологии развития плода. В онкологии этот анализ проводят с целью определения маркеров новообразований, чтобы иметь возможность контролировать эффективность лечения. В иммунологии РИА применяется для исследования в крови наличия иммуноглобулинов, ферментов, белков и так далее. Сегодня данный анализ позволяет выявлять концентрацию различных гормонов до миллионной части одного грамма. Таким образом, радиоиммунный анализ кровишироко применяется в кардиологии, онкологии, эндокринологии, гинекологии и вирусологии.
Методы РИА
Принято различать несколько методов анализа, в зависимости от характера реакции:
- Неконкурентный метод характеризуется такими компонентами реакции, как стандартный и определяемый антигены, буферный раствор, антитела, что помечены изотопом, определенные антитела, что связываются на сорбенте. К антителам добавляют антиген, который исследуется. После инкубации появляются комплексы антиген-антитело, сорбент омывают, добавляют помеченные антитела, что вступают в связь с антигеном в составе комплекса. Радиоактивность зависит от концентрации антигена, что исследуется.
- Конкурентный радиоиммунный анализ обуславливается конкуренцией антигена. Здесь имеются такие компоненты реакции, как контрольный и определяемый антигены, буферный раствор, определенные антитела, что связываются на сорбенте, а также антиген, помеченный изотопом. Диагностирование начинается с ввода антигена, что исследуется. На сорбенте образуется комплекс антиген-антитело. Дальше омывается сорбент, и вводят помеченный антиген. При этом он вступает в связь с антителом. При помощи счетчиков измеряют реакцию и величину радиоактивности. Она будет в обратной пропорции относительно количества антигена в пробе.
- Непрямой метод является самым распространенным. В этом случае радиоиммунный анализ компоненты реакции имеет такие, как контрольная и исследуемая сыворотка, антигены или антитела, которые связаны на сорбенте, антитела, помеченные изотопами, растворы буферов. Антитела или антигены, что диагностируются, вступают в реакцию с антигенами или антителами, которые связаны на сорбенте. Потом удаляют инкубат, вводят помеченные антитела, что вступают в связь с комплексами антиген-антитело.
Методика проведения анализа
Так, радиоиммунный анализ проводится при помощи особых реагентов. Наборы стандартные, поэтому какие-либо погрешности или нарушения не допускаются. Результаты диагностики получаются достоверными. Анализ проводят утром, для этого берут у человека венозную кровь. В лаборатории от крови отделяют сыворотку, которая будет применяться для РИА. Эту сыворотку смешивают с реагентами. Полученная смесь проходит инкубацию при заданной температуре в термостате.
В полученной смеси разделяют свободные и связанные изотопы. После этого полученный материал исследуется, и просчитываются результаты. Механизм радиоиммунного анализа имеет несколько вариантов. Методика, что описана выше, является РИА жидкофазным, так как все компоненты имеют жидкое состояние. Есть РИА и твердофазный, где антитела кладут в носитель, который не растворяется в жидкости.
Доступность диагностики
Использование этого метода диагностики в медицине с каждым годом становится все популярнее. В последнее время радиоиммунный анализ становится стандартным методом диагностики, который может быть назначен врачом при постановке окончательного диагноза. Долгое время этот вид анализа проводился только в лабораториях, сегодня он стал обычным методом исследования. Но РИА требует применения дорогостоящего оборудования (гамма-счетчиков), а наборы реагентов имеют короткий эксплуатационный срок. Все это является основным недостатком такого анализа, что определяют его дорогую стоимость.
Кроме того, в последнее время РИА стали вытеснять более современные методы исследования, которые не требуют взаимодействия с изотопами. К таким относится иммуноферментный анализ. Таким образом, РИА является желанным во многих клиниках. В больших городах и центрах диагностики он давно используется, но в обычных больницах маленьких городов этот анализ практически не применяется из-за своей дороговизны.
Достоинства РИА
Радиоиммунный анализ имеет множество достоинств. Он достаточно специфичен и имеет высокую чувствительность, что позволяет определить наличие биологически активных веществ в невероятно малых количествах. Проводится этот анализ очень просто, от человека требуется только сдать венозную кровь. Результаты теста получаются точными на все 100% и готовы уже на следующий день. Также РИА с легкостью можно автоматизировать. Таким образом, этот анализ позволяет выявлять белки, которые представляют собой продукты жизнедеятельности инфекционных бактерий, что свидетельствует о наличии инфекции в организме.
Диагностика в вирусологии
Самым перспективным РИА является для вирусологии, поскольку позволяет в короткие сроки выявить вирусных возбудителей. Связано это с тем, что в последнее время растет число заболеваемости различными инфекциями, которые распространяются с большой скоростью, вызывая смертность среди людей. Особенно это касается стран, которые не имеют высокого социального и экономического развития (страны Дальнего Востока), здесь просто незаменим радиоиммунный анализ. Микробиология также применяет этот метод диагностики для выявления инфекционных болезней, которые вызывают патогенные бактерии. Например, РИА широко используют для выявления брюшного тифа. В первые дни недуга до назначения лечения необходимо проведение исследования кала и рвотных масс. Однако результаты диагностирования будут получены через длительное время. Здесь на помощь приходит РИА, анализ позволяет в короткий срок выявить возбудителя заболевания. Человек сдает кровь, на следующий день уже готовы результаты исследования. Этот анализ помогает в постановке точного диагноза.
Итоги
Радиоиммунный анализ является на данный момент одним из самых чувствительных методов диагностирования. Он используется для анализа любого вещества, против которого можно получить антитела. Этот метод дает возможность сделать множество проб в самом маленьком объеме исследуемой жидкости, а также в кратчайшие сроки провести учет результатов, так как он может быть полностью автоматизирован. Этот анализ был разработан в пятидесятых годах прошлого столетия Соломоном Берсоном. Через тридцать лет он получил широкое распространение. На сегодняшний день РИА нет стопроцентной альтернативы, так как анализ имеет высокую чувствительность. РИА используют в различных отраслях медицины, а также в микробиологии и вирусологии.
Напоследок
Использование метода в вирусологии очень актуально сегодня, так как дает возможность исследовать распространение инфекций, поставить точный диагноз и назначить специфическое лечение. Особенно эта проблема актуальна для стран, которые имеют низкий уровень экономики и социального развития. Также этот анализ позволяет выявлять количество гормонов и ферментов в организме человека. Для того чтобы получить достоверные результаты, исследуемому необходимо только сдать кровь на анализ. Медицина не стоит на месте, наряду с радиоиммунным анализом появляются новые методы исследования, но РИА продолжает оставаться одним из ведущих в медицинской диагностике.
Источник
Радиоиммунологический метод (РИА; син. радиоиммунологический анализ) — основанный на реакции антиген—антитело метод количественного определения биологически активных соединений, обладающих антигенными свойствами, и антигенов микроорганизмов с помощью аналогичных известных антигенов или антител, меченных радиоактивным изотопом. Радиоиммунологический метод позволяет количественно определять в жидкостях организма (сыворотка крови, моча и др.) содержание гормонов и различных антигенов, в т. ч. антигенов микроорганизмов. Основным достоинством Радиоиммунологического метода является его очень высокая чувствительность благодаря использованию изотопной метки антигенов (или антител) и применения сывороток с высоким сродством и специфичностью антител (см.).
Становление и развитие Радиоиммунологического метода связано с работой Ялоу и Берсона (R. S. Yalow, S. A. Berson, I960), предложивших этот метод для определения эндогенного инсулина в плазме крови.
Сущность Р. м. состоит в использовании для определения антигенов (см.) соответствующих иммунных сывороток и введении в систему антиген — антитело антигена, меченного радиоактивным изотопом, напр, йода (125I), в результате чего происходит связывание определяемого (немеченого) и меченого антигена с ограниченным количеством антител. Т. к. меченый антиген добавляется в определенной дозе, то можно определить, какая его часть связалась с антителами, а какая часть осталась несвязанной в результате конкуренции с выявляемым немеченым антигеном. При определенных концентрациях количество меченого антигена, связавшегося с антителами, обратно пропорционально количеству определяемого антигена. Схематически этот процесс можно изобразить следующим образом:
После взаимодействия антигенов с антителами образовавшиеся комплексы антиген—антитело (см. Антиген-антитело реакция) отделяют от свободного меченого антигена. Отделение комплекса антиген—антитело производят различными способами: с помощью электрофореза (см.), гель-фильтрации (см.), фракционного осаждения иммунного комплекса этанолом, сульфатом аммония и др., а также с помощью агрегации иммунных комплексов антиглобулиновой сывороткой или сорбции их на иммобилизованных (прикрепленных к поверхности твердой фазы) антителах. Кроме этого, возможна сорбция свободного меченого антигена с помощью добавленных веществ, напр, талька, целлюлозы, кварца, активированного угля и др. Отделив меченый несвязанный антиген от комплекса антиген— антитело, определяют количество меченого антигена, связавшегося в комплексе но количеству импульсов (с помощью сцинтилляционного счетчика). Снижение количества импульсов в единицу времени в сравнении с соответствующими контролями свидетельствует о присутствии гомологичного меченого антигена, связанного с анти-сывороткой, в результате чего меченый антиген не вступил в реакцию и не определяется в комплексе антиген— антитело.
Иммунную сыворотку против определяемого антигена и меченого антигена предварительно оттитровывают и используют в Р. м. в оптимальном разведении, при к-ром происходит связывание 50% внесенной метки. Для оценки результатов применяют данные (график) зависимости связывания меченого антигена сывороткой в оптимальном разведении от концентрации меченого (стандартного) антигена.
Широко применяются в Р. м. антитела сыворотки против антигена, иммобилизованные (адсорби рованные) на поверхности пластика или химически связанные с поверхностью полимера. В 1966 г. Кетт (K. J. Catt) с группой исследователей, а также Уайд и Порат (L. Wide, J. P. Porath) применили в Р. м. иммобилизацию антител на полимере. Была показана возможность иммобилизации антител на сефадексе и целлюлозе, обработанных бромцианом, а также на различных пластмассах без предварительной обработки активатором. Для проведения реакции в полистироловые пробирки с иммобилизованными на внутренней поверхности антителами вносят определяемый антиген. После инкубации несвязанный антиген удаляют промыванием и вносят меченый антиген, который затем удаляют таким же образом, определяя в дальнейшем долю связанной радиоактивной метки.
Существует разновидность Р. м.— метод двойной системы антител, когда комплекс антиген—антитело обрабатывается антиглобулиновой преципитирующей сывороткой (вторые антитела) с последующим отделением преципитата центрифугированием. Добавление вместе с антиглобулиновой сывороткой нормальной сыворотки крови того же животного. от к-рого получены первые антитела, способствует преципитации комплексов.
Определение антигена с помощью меченых антител получило название иммунорадиометрического метода. В этом случае антиген предварительно фиксируют на твердой фазе, напр, в полистироловых пробирках. При постановке реакции определяемый антиген образует комплекс с мечеными антителами, который остается в растворе, а не прореагировавшие антитела взаимодействуют с антигеном, прикрепленным к твердой фазе. В варианте иммунорадиометрического метода — методе двойного связывания — определяемый антиген образует комплекс с антителами, иммобилизованными на твердой фазе. Затем после удаления свободного антигена промыванием поверхности твердой фазы добавляются меченые антитела, выявляющие комплекс. Радиоактивность комплекса антитело — антиген — антитело — 125I сравнивается с радиоактивностью контрольных проб, проб, заведомо содержащих и не содержащих антиген.
Высокая чувствительность Радиоиммунологического метода (до пикограмм определяемого вещества) позволила более точно определить концентрацию многих биологически активных соединений. К недостаткам Р. м. относят возможное снижение специфичности за счет посторонних примесей в определяемом образце, напр, некоторых лекарств, и наличие в сыворотке крови перекрестно реагирующих антител. Кроме того, у антигенов и антител, меченных гамма-излучающими изотопами, короткий срок хранения; при работе с ними следует соблюдать особые меры безопасности. В этом отношении существует менее опасный метод, сходный по принципу с Р. м., в к-ром применяются антигены или антитела, меченные ферментом (см. Энзим-иммунологический метод). Широкое внедрение Р. м. затруднено из-за трудности получения стандартных меченых сывороток и антигенов, необходимости соблюдать правила работы с радиоактивными веществами, применять дорогостоящее оборудование (гамма- и бета-счетчики, камеры глубокого охлаждения, компьютеры и др.) и реактивы с высоким требованием к чистоте стандартов, а также высокоспецифические сыворотки.
См. также Радиоизотопное исследование.
Библиография: Иммунологические методы исследования в клинике и эксперименте, под ред. А. Я. Лысенко, М., 1978; Иммунологические методы, под ред. X. Фримеля, пер. с нем., М., 1979; Чард Т. Радиоиммунологические методы, пер. с англ., М., 1981, библиогр.; Yаlоw R. S. a. Berson S. A. Immunoassay of endogenous plasma insulin in man, J. clin. Invest., v. 39, p. 1157, 1960.
А. С. Быков.
Источник: Большая Медицинская Энциклопедия (БМЭ), под редакцией Петровского Б.В., 3-е издание
Рекомендуемые статьи
Источник
Важным направлением изотопной диагностики является использование радионуклидов для медицинских целей, но вне тела человека. К таким методам относится радиоиммунный анализ.
Этот вид анализа не требует построения изображений. Он основан на иммунных реакциях с использованием меченых соединений и отличается высокой чувствительностью и специфичностью.
В лабораторных (in vitro) исследованиях радиоактивное вещество добавляют к образцам тканей, взятым из организма пациента. Активность образцов измеряются при помощи счётчиков радиоактивных излучений, специально предназначенных для исследования биологических проб: у- и (3-радиометры с автоматической сменой проб для определения in vitro гормонов и других биологических веществ в средах организма и колодезные счётчики, наиболее часто применяемые для измерения объёма циркулирующей крови.
Радиоиммунный анализ (РИЛ) — метод количественного определения биологически активных веществ в биологических жидкостях, основанный на конкурентном связывании искомых стабильных и аналогичных им меченных радионуклидом веществ со специфическими связывающими системами (обычно — со специфическими антителами).
Наличие или отсутствие некоторого радиоактивного материала легко детектировать, даже если он существует в очень небольшой концентрации. Радиоизотопами можно метить молекулы образцов in vitro (вне тела). Существуют сотни тестов для определения состава крови, сыворотки, мочи, гормонов, антигенов и многих лекарств посредством посредством конкурентной ассоциации радиоактивно меченых и соответствующих им немеченых соединений со специфическими к ним системами.
РИА был впервые разработан (i960) для определения уровня эндогенного инсулина в плазме крови человека. Метод основан на конкуренции определяемого вещества со своим меченым аналогом за ограниченное число мест связывания у высокоспецифичных антител. В тест-системе радиоактивный лиганд связывается с антителами, специфическими к немеченому лиганду, в результате чего образуется комплекс «меченый лиганд — антитело». Определяемый гормон (лиганд) плазмы крови конкурирует с меченым аналогом за связывающие места антитела и тем самым снижает взаимодействие последнего с меткой. Поэтому соотношение концентраций свободного и связанного с антителом лигандом уменьшается. Связанную и свободную формы меченого соединения разделяют одним из известных способов (адсорбция, фракционное осаждение, метод двойных антител и т.д.) Заключительными этапами РИА являются радиометрия одной из фракций, построение калибровочной кривой, отражающей динамику изменений радиоактивности связанного (или свободного) лиганда в зависимости от количества внесенного в пробирку немеченого аналога (стандарта). Концентрация целевого вещества (например, гормона) в анализируемом образце устанавливается сравнением скорости счета анализируемого образца со скоростью счета стандартного образца с последующим перенесением полученного значения на калибровочную кривую.
Рис. 1. Канальный гамма-радиометр для радио- имунного анализа in vitro.
К РИА относятся: проведение анализа без предварительного разведения анализируемых проб; высокая чувствительность — способность выявлять минимальные количества вещества; специфичность — измерение количества только одного строго определенного вещества; точность — определение истинного количества вещества; воспроизводимость результатов; возможность повторения результатов в одной пробе при анализе наборами из разных партий; простота выполнения анализа и значительная пропускная способность, дающая возможность проводить без особых трудностей большое количества проб; отсутствие лучевой нагрузки на больного.
Недостатками РИА считаются: недолговечность хранения меченого лиганда по причине физического распада метки, её отщепление от реактива и радиолиза носителя; разрушение лиганда при йодировании; необходимость высокой очистки лиганда; недостаточная чувствительность при низком содержании определяемого вещества в биологических жидкостях; низкая специфичность, обусловленная неселективным связыванием меченого соединения компонентами плазмы крови; необходимость предварительной экстракции определяемого лиганда в тех случаях, когда он связан с белками или липопротеидами плазмы, а также при наличии в крови веществ, обладающих перекрестной иммунореактивностью по отношению к определяемому лиганду. Несмотря на недостатки РИА в настоящее время является самым распространенным методом радиоизотопного анализа.
Радиоиммунный анализ предназначен для количественного определения in vitro биологически активных веществ (гормонов, ферментов, лекарственных препаратов) в биологических жидкостях, основанное на конкурентном связывании таких веществ, находящихся в полученном от пациента биологическом материале, и аналогичных им меченных радионуклидом веществ, входящих в состав реактива (и те и другие чаще всего являются антигенами), со специфическими к ним антителами. Так как меченый антиген добавляют в определённом количестве, можно определить, какая часть его связалась с антителами и какая осталась несвязанной в результате конкуренции с определяемым неактивном антигеном.
В радиоиммунном анализе используют РФП на основе меченных радионуклидами (зН, 14С, згр, ззр, 131J, >23j, min и др.) антител или антигенов, но чаще всего применяют изотоп йода 12r>J, который имеет период полураспада 6о дней и высокую удельную радиоактивность.
Антитела (иммуноглобулины) — растворимые гликопротеины, присутствующие в сыворотке крови, тканевой жидкости или на клеточной мембране, которые распознают и связывают антигены. Иммуноглобулины синтезируются В-лимфоцитами (плазматическими клетками) в ответ на чужеродные вещества определенной структуры — антигены. Антитела исполызуются иммунной системой для идентификации и нейтрализации чужеродных объектов, например, бактерий и вирусов. Антитело — важный фактор специфического гуморального иммунитета, состоит из двух лёгких и двух тяжёлых цепей.
Антитела представляют собой белки глобулиновой фракции сыворотки крови, образующиеся в ответ на введение в организм человека или теплокровных животных бактерий, вирусов, белковых токсинов и других антигенов. Связываясь активными участками (центрами) с бактериями или вирусами, они препятствуют их размножению или нейтрализуют выделяемые ими токсические вещества. Защитное действие антител, содержащихся в иммунных сыворотках, широко используется в терапии и профилактике инфекционных заболеваний.
Антиген («зачинщик выработки антител») — вещество, которое организм считает чужеродным или потенциально опасным. Против антигена организм начинает вырабатывать собственные антитела — этот процесс называется иммунным ответом (аллергическая реакция).
Антигены представляют собой высокомолекулярные вещества, которые при введении в организм человека вызывают образование специфических реагирующих с ними антител. Непременным условием антигенно- сти является их отличие от веществ, имеющихся в норме в организме реципиента. К антигенам относятся чужеродные белки, некоторые полисахариды (большей частью бактериального происхождения), комплексы белков с разнообразными химическими соединениями.
Особая разновидность метода — иммунорадиометрический анализ (ИРМА), в котором используются меченые антитела, в отличие от РИА, где используются меченые антигены.
Для проведения РИА необходимо иметь специфическое к антигену антитело, меченный радионуклидом антиген, чистый немеченый антиген, используемый как стандарт, метод отделения комплекса радиомеченный антиген-антитело, счётчик радиоактивности.
Обычно меченный ,2r>J антиген с высокой удельной активностью приготавливают йодированием остатков тирозина в молекуще антигена и с последующим удалением свободного изотопа методом гель-фильтрации. Готовый к использованию меченый антиген с известной удельной активностью входит в состав продажных наборов для РИА.
Рис. 2. Конкурирующие реакции, протекающие в РИА.
В РИА выбор радиоактивной метки не ограничен, т. к. методы измерения активности, используемые in vitro весьма чувствительны. Большой период полураспада радионуклидов, используемых РФП удобен для применения. Используются изотопы биологически значимых элементов (железо или кобальт). Йод удобен, т.к. может быть легко встроен во многие органические молекулы. Энергия радиоактивного распада не должна быть слишком большой. Высвобождение большого количества энергии может разорвать химические связи и привести к снижению химической стабильности. Например, 12sj предпочтительнее, чем ЗД, а ззр предпочтительнее, чем згр.
Для радиоиммунного анализа выпускают стандартные наборы реагентов, каждый из которых предназначен для определения концентрации какого-либо одного вещества.
Радиоиммунный анализ широко используется в лабораторной диагностике. С помощью РИА, ИРМА (RIA/IRMA) в биологических жидкостях определяют количество биологически активных веществ (гормонов, факторов роста, ферментов, маркеров злокачественных новообразований).
Метод используют в диагностике заболеваний сердечно-сосудистой, эндокринный и других систем, для установления причин бесплодия, нарушения развития плода, в онкологии для определения маркеров опухолей и контроля за эффективностью лечения, для определения концентрации в крови иммуноглобулинов, ферментов и лекарственных веществ. В ряде случаев исследования выполняют на фоне нагрузочных функциональных проб, либо в динамике. Реакции с использованием меченых антител и антигенов составляют основу методов экспресс-диагностики инфекционных заболеваний, так как выявляют минимальное содержание Аг и Ат в исследуемых образцах.
РИА — чувствительный метод измерения ничтожных количеств гормонов, содержащихся, например, в крови или желудочном соке больного, т. е. измерение таких малых концентраций, которые нельзя определить другим методом. С помощью РИА легко и быстро диагностируют недостаток или избыток гормонов, причём можно определить уровень содержания гормонов в миллионных частях одной миллионной части грамма. РИА для определения антигена, присутствующего в организме при гепатите, стал методом отбора во время выявления инфицированной крови по линии Красного Креста или других станций переливания крови. С помощью РИА возможна ранняя диагностика развивающейся туберкулезной бактерии.
Радиоимунный анализ используется для определения объёма циркулирующей крови, при проведении дыхательного теста для выявления Helicobacter pylori, при исследовании продолжительности жизни эритроцитов, при диагностике желудочно-кишечного тракта, при ренографии, определении йодпоглотителыюй функции щитовидной железы, а также при изучении метаболизма витамина В12, железа, и др. Антигены, меченные 125j, используются для определения гормонов Т3 и Т4, секретируемых щитовидной железой.
Радиоактивный йод используется в качестве метки для определения содержания в организме гормона инсулина. У больных, страдающих диабетом, этот гормон стимулирует образование специальных антиинсу- линовых антител, которые соединяются с инсулином. После введения инсулинового индикатора кровь пациента подвергается анализу методами электрофореза или хроматографии, а компоненты присутствующих в крови антител обследуются на содержание в них радиоактивных веществ.
РИА активно используется в обнаружении наркотиков.
Источник
