Пцр анализ крови у кошки

Если у кошки появляются симптомы болезни, хозяину предлагают сдать животному анализ ПЦР. Показанием является подозрение на такие недуги, как токсоплазмоз, панлейкопения, герпес-вирус, гельминтоз, патогенные грибки. Существует несколько видов биоматериала, необходимые для исследования, а сам анализ проводится в 4 этапа. От правильного проведения процедуры зависит результат.

По мнению ветеринаров, ПЦР-диагностика очень точная, поскольку этим методом можно определить вирус даже в самом минимальном количестве.

Что такое ПЦР и как проводится?

Полимеразная цепная реакция позволяет выявить возбудителя инфекционных недугов или гельминтоза. Для проведения анализа применяются специальные ферменты, которые вводят в пробы собранного материала. Вещество копирует ДНК болезнетворного микроба. Затем полученные фрагменты соотносят с видом микроорганизма, занесенного в базу данных, а также определяется его количество в биоматериале. Это позволяет обнаружить возбудителя на клеточном уровне или если его антигенная изменчивость повышена. Для проведения анализа подходит следующий биоматериал:

• Кровь.
• Соскоб со слизистых глаз, носа, ротовой полости, влагалища.
• Кал. Собирают из предварительно очищенного лотка и упаковывают в контейнер.
• Урина. При заборе может потребоваться проведение цистоцентеза.

Вернуться к оглавлению

Этапы исследования

Центрифугирование биоматериала – один из этапов проведения исследования.

После взятия биоматериала, ПЦР у кошек проводится таким образом:

1. Подготовка собранных тканей к анализу с помощью центрифугирования.
2. Выделение ДНК из клеток.
3. Копирование сомнительных участков ДНК-цепи с применением тестов, содержащих олигонуклеотиды, присущие отдельному возбудителю. Пробирка с добавленными образцами помещается в термостат и задается необходимая температура.
4. Проводится электрофоретическая детекция, после которой ДНК-комплекс высвечивается под УФ-облучением.

Вернуться к оглавлению

Когда проводится анализ?

Исследование ПЦР имеет несколько разновидностей и назначается котам при заболеваниях, показанных в таблице:

Вернуться к оглавлению

Как интерпретируется результат?

Устанавливает диагноз и делает выводы исследования только ветеринар. Самостоятельная интерпретация запрещена. Положительный результат считается при обнаружении частиц ДНК патогенного микроорганизма. Это указывает на заболевание и назначается соответствующее лечение. Отрицательным результатом является отсутствие специфических ДНК-фрагментов.

Вирус иммунодефицита кошек (FIV)

ОПИСАНИЕ

Вирус иммунодефицита кошек (Feline Immunodeficiency Virus, FIV) — это оболочечный РНК-содержащий вирус, принадлежащий роду Lentivirus семейства Retroviridae. Вирус поражает домашних и диких кошек повсеместно. Как и вирус иммунодефицита человека, FIV вызывает хроническую персистирующую инфекцию, которая у некоторых кошек становится причиной иммунодефицита.
FIV, как и другие ретровирусы, неустойчив к действию факторов внешней среды (выживает вне организма хозяина в течение нескольких минут) и быстро инактивируется дезинфектантами. FIV в. высокой концентрации содержится в слюне, основным путем передачи инфекции являются укусы больных животных. Имеются сведения о трансплацентарной передаче, передаче при родах, а также с молоком. В экспериментальных условиях эти пути передачи не являются значимыми в случае спонтанной инфекции, а у котят, инфицированных таким образом, может не происходить развития болезни. Данных о передаче инфекции половым путем нет, но FIV обнаруживается в сперме. Возможна передача вируса при переливании крови от инфицированного животного.
Средний возраст животных, в котором чаще всего диагностируется инфекция, составляет от шести до восьми лет (от 80 до 90% кошек). Коты бывают серопозитивными в 4,7 раза чаще, чем кошки. Содержание животных в помещении является фактором, снижающим вероятность передачи, но не исключает ее полностью.
Основной мишенью для FIV являются CD4+ T-клетки. Однако вирус также поражает CD8+ T-клетки, B-клетки, макрофаги, дендритные клетки, клетки микроглии и астроциты. Влияние вируса на иммунную систему комплексное, до конца не изучено и включает как иммуносупрессию, так и активацию иммунитета.
Существуют три фазы болезни: острая (первичная), субклиническая и терминальная, хотя у спонтанно инфицированных кошек могут наблюдаться не все фазы. После инокуляции происходит репликация вируса в лимфоидной ткани. Через две недели после инфицирования отмечается виремия с высокой концентрацией вируса. Пиковые значения фиксируются через 8–12 недель после инфицирования. При этом наблюдается снижение концентрации CD4+ и CD8+ T-клеток в периферической крови. Для некоторых кошек в острой фазе болезни характерны летаргия, лихорадка, анорексия, диарея, стоматит и/или лимфаденопатия.
В субклинической фазе болезни происходит восстановление уровня CD4+ T-клеток, а концентрация вируса в плазме крови снижается до очень низкого уровня. Субклиническая инфекция у кошек может сохраняться в течение нескольких лет и даже на протяжении всей жизни. Эта фаза болезни не аналогична латентной инфекции, поскольку размножение вируса происходит в незначительном объеме. Наблюдается снижение показателя соотношения CD4+ : CD8+ T-клеток; у некоторых кошек отмечается гиперглобулинемия, вызванная гиперактивацией B-клеток. Скорость прогрессирования субклинической фазы определяется такими факторами, как штамм вируса, наличие коинфекций другими патогенами, функциональным состоянием иммунной системы хозяина. У некоторых животных данные изменения в итоге приводят к развитию терминальной фазы заболевания, которая характеризуется клиническими симптомами оппортунистических инфекций, неоплазией, миелосупрессией и неврологическими симптомами. Эта фаза болезни чаще всего диагностируется у спонтанно инфицированных кошек. Однако у многих инфицированных животных никогда не происходит развития клинических симптомов даже при низком уровне CD4+ T-клеток. Терминальная фаза инфекции FIV обычно сопровождается умеренным или тяжелым периодонтитом, лимфоплазмоцитарным стоматитом, гингивитом или одонтокластическими резорбтивными поражениями, которые могут быть вызваны опортунистическими бактериальными или вирусными инфекциями.
У многих кошек инфекция FIV диагностируется при проведении скрининга. Скрининг осуществляется с использованием методов, позволяющих обнаружить антитела к FIV, ввиду их доступности, чувствительности и быстроте проведения анализа.
При получении положительных результатов роль FIV в. развитии тех или иных симптомов может быть неочевидной. Однако вирус может быть причиной лимфомы, тяжелого стоматита, инфекций, вызванных другими патогенами (например, микоплазмами).
Для диагностики FIV доступны серологические методы исследования, направленные на обнаружение антител к вирусу иммунодефицита (иммунохроматографический анализ ‒ ИХА, Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay ‒ ELISA). Также используется и метод полимеразной цепной реакции (ПЦР). Для выявления FIV-ассоциированных заболеваний FIV-инфицированным кошкам рекомендуется проводить дополнительные обследования (общий и биохимический анализ крови, анализ мочи и фекалий, тестирование на FeLV, ПЦР для исключения гемотропных микоплазм).
Для диагностики инфекции FIV был разработан ряд тест-систем ПЦР (в реальном времени с обратной транскрипцией), с помощью которых обнаруживаются вирусная РНК, провирусная ДНК или РНК и провирусная ДНК в образцах периферической крови. Наиболее широкое применение нашла ПЦР, выявляющая провирусную ДНК в режиме реального времени. В сравнении с серологическими методами исследования чувствительность ПЦР может быть ниже (< 80%) ввиду очень низкой вирусной нагрузки, а также из-за невозможности обнаружения вирусов некоторых штаммов, что связано с вариабельностью вирусного генома. Учитывая вышесказанное, для диагностики FIV результат ПЦР-исследования (отрицательный или положительный) необходимо сопоставлять с результатами серологических исследований (ELISA, ИХА), особенно у клинически здоровых животных. У серонегативных кошек с положительным результатом исследования методом ПЦР может иметь место терминальная фаза болезни при невозможности выработки антител.

ПРЕАНАЛИТИКА

Для исследования основным биоматериалом является сыворотка крови. Рекомендовано соблюдение голодной диеты в течение минимум 6 часов. Образец стабилен 5 суток при температуре +2С…+8С.

ИНТЕРПРЕТАЦИЯ

Результаты исследования содержат информацию исключительно для врачей. Диагноз ставится на основании комплексной оценки различных показателей, дополнительных сведений и зависит от методов диагностики.

У кошек с положительным результатом исследования методом ПЦР на наличие провирусной ДНК и отрицательным результатом на наличие растворимого антигена имеет место регрессирующая инфекция. Такие кошки не являются источником инфекции, однако возобновление выделения вируса может наблюдаться у них после стресса или иммуносупрессии, передача вируса возможна при переливании крови от таких животных. У кошек с регрессирующей инфекцией провирусная ДНК обычно присутствует в гораздо меньшей концентрации, чем у кошек с прогрессирующей формой. Использование для исследования образцов костного мозга вместо образцов цельной крови позволяет повысить чувствительность обнаружения провирусной ДНК.
Интерпретация результатов исследования методом ПЦР должна проводиться с осторожностью. Ретровирусы характеризуются высокой интенсивностью мутаций, наличие вариаций последовательностей может привести к получению ложноотрицательных результатов. Ввиду того, что в вакцине против FeLV используется инактивированный или рекомбинантный вирус, получение ложноположительных результатов у вакцинированных животных невозможно.

РЕЗУЛЬТАТ ИССЛЕДОВАНИЯ

Тест качественный. Результат выдается в терминах «Антитела к вирусу иммунодефицита (FIV) обнаружены», «Антитела к вирусу иммунодефицита (FIV) не обнаружены».

Вирусная лейкемия кошек (FeLV)

ОПИСАНИЕ

Вирусная лейкемия кошек вызывается FeLV (Feline Leukemia Virus) — оболочечным РНК-содержащим вирусом рода Gammaretrovirus, принадлежащим семейству Retroviridae. Инфекция FeLV является одной из ведущих причин смерти кошек, вызывая иммуносупрессию, патологии костного мозга и развитие опухолей гематопоэтической ткани.
Инфекция FeLV прогрессирует быстрее, чем FIV, и является более патогенной, поэтому кошки с прогрессирующими инфекциями обычно погибают вследствие осложнений. В отличие от FIV, у многих кошек на ранней стадии инфекции FeLV наблюдается регресс до начальной стадии латентного вирусоносительства («регрессирующая инфекция»).
Передача FeLV-A происходит преимущественно при контакте со слюной больного животного, например, при вылизывании, взаимном груминге и совместном использовании мисок для корма и воды. Также возможна передача при укусах (в том числе блошиных), переливании крови от больных животных, с молоком.
Вирус неустойчив к действию факторов внешней среды и быстро инактивируется дезинфектантами, мылом и при высушивании. Общая распространенность инфекции FeLV снизилась за последнее время благодаря широкому внедрению в практику специальных методов исследования и вакцинации. Риск развития инфекции повышен у животных, имеющих доступ на улицу, контактирующих с другими кошками, интактных котов, отличающихся агрессивностью, а также кошек с коинфекцией FIV.
Болезнь чаще отмечается у взрослых кошек, чем у молодых животных в возрасте до шести месяцев. Средний возраст инфицированных животных составляет три года, что меньше, чем для FIV.
Варианты исхода инфекции FeLV могут быть разнообразными и зависят от штамма и дозы вируса, путей передачи инфекции, факторов, влияющих на функцию иммунной системы хозяина (возраста, генетики, наличия коинфекций, стресса, применения иммуносупрессивных препаратов).
Вирус проникает в организм ороназальным путем, репликация происходит в лимфоидной ткани ротовой полости, поражая моноциты и лимфоциты. Затем инфекционный агент попадает в циркуляторное русло. В этот период у некоторых кошек могут развиваться симптомы системной патологии, такие как лихорадка, летаргия и/или лимфаденопатия. Небольшое число пораженных лимфоцитов проникает в костный мозг, где вирус быстро инфицирует делящиеся клетки-предшественницы гемопоэза, а затем — лимфоидные и эпителиальные клетки различных органов. Поражение костного мозга считается критическим этапом патогенеза инфекции FeLV. После инфицирования эпителиальных клеток слюнных желез вирус в больших количествах выводится со слюной; небольшие количества вируса могут выводиться с мочой и фекалиями.
У некоторых кошек репликация вируса подавляется иммунной системой в течение нескольких недель после инфицирования, затем происходит поражение костного мозга. У таких животных развивается регрессирующая инфекция, при которой провирусная ДНК обнаруживается в геноме клеток хозяина, но размножения и выделения вируса не происходит. Развитие регрессирующей инфекции возможно после периода виремии, также допустимо отсутствие вирусемии. Регрессирующая инфекция может персистировать в течение всей жизни животного и активироваться при иммуносупресии, например, в период беременности или при использовании иммуносупрессивных препаратов. Впоследствии у некоторых кошек с регрессирующей инфекцией могут развиться FeLV-негативные новообразования. При абортивной инфекции виремия не наблюдается, вирус не обнаруживается лабораторными методами. Инфицирование кошек абортивной инфекцией происходит небольшими дозами вируса, поэтому, несмотря на отсутствие виремии, у них отмечается наличие антител к вирусу. Развитие прогрессирующей инфекции у животных происходит после включения в патологический процесс костного мозга, а интенсивность разрушения клеток инфекционным агентом ограничивает способность иммунной системы хозяина подавлять репликацию вируса.
Инфекция FeLV часто диагностируется во время скрининговых обследований клинически здоровых кошек. Скрининг проводится с использованием ИФА или иммунохроматографических методов обнаружения антигена FeLV в. сыворотке крови ввиду их высокой чувствительности, специфичности, быстроте выполнения и доступности.
Несмотря на то, что у многих кошек, у которых обнаруживают антиген, клинические признаки отсутствуют, необходимо проведение клинического и биохимического исследований крови, исследования мочи для выявления нарушений, которые могут указывать на наличие патологий, вызванных инфекцией FeLV. Слабо выраженные изменения состава крови, такие как эритроцитарный макроцитоз или моноцитопения, могут иметь место при отсутствии выраженных клинических симптомов и указывать на неблагоприятный исход болезни в долгосрочной перспективе.
К дополнительным тестам, рекомендованным к проведению у кошек с анемией, относятся определение количества ретикулоцитов, проба Кумбса и ПЦР на наличие гемоплазм. Для животных с панцитопенией и персистирующими нерегенеративными анемиями рекомендовано исследование аспирата костного мозга и кор-биоптата.
Существует ряд тест-систем ПЦР для обнаружения нуклеиновой кислоты FeLV. В настоящее время основными показаниями к проведению ПЦР являются: 1) скрининг потенциальных доноров крови наряду с тестированием на наличие антигена; 2) выявление регрессирующей инфекции при подозрении на наличие FeLV как причины неоплазии при получении отрицательных результатов тестирования на наличие антигена.
С помощью ПЦР (в реальном времени с обратной транскрипцией) возможно обнаружение РНК FeLV или провирусной ДНК. При проведении скрининга или диагностики FeLV необходимо избегать применения ПЦР без тестирования на наличие антигена. Врач-клиницист должен знать, используется обнаружение провирусной ДНК, вирусной РНК или обеих нуклеиновых кислот ввиду того, что клиническая значимость положительного результата на наличие вирусной РНК отличается от таковой для провирусной ДНК (которая позволяет предположить наличие непродуктивной инфекции у кошек с отрицательными результатами теста на антиген). После инфицирования возможно получение положительных результатов исследования методом ПЦР в реальном времени в течение нескольких недель до того, как могут быть получены положительные результаты теста на антиген и выделение вируса. Таким образом, ПЦР является более чувствительным методом, чем тест на наличие растворимого антигена. Высокая концентрация вирусной РНК в крови и слюне обычно наблюдается при прогрессирующей инфекции, а низкая — при регрессирующей.
Для определения провирусной ДНК методом ПЦР используются образцы крови, лейкотромбоцитарного слоя, костного мозга или иных тканей кошек, негативных на антиген FeLV.

ПРЕАНАЛИТИКА

Для исследования методом тИФА (твердофазный иммуноферментный анализ) основным биоматериалом является сыворотка крови. Рекомендовано соблюдение голодной диеты в течение минимум 6 часов. Образец стабилен 5 суток при температуре +2С…+8С.

ИНТЕРПРЕТАЦИЯ

Результаты исследования содержат информацию исключительно для врачей. Диагноз ставится на основании комплексной оценки различных показателей, дополнительных сведений и зависит от методов диагностики.

РЕЗУЛЬТАТ ИССЛЕДОВАНИЯ