Иммуноферментный анализ крови на гепатиты

Вирусом гепатита С заражено около 170 миллионов человек по всему миру. Болезнь коварная – при смазанной симптоматике начала заболевания ее дебют проходит незамеченным. Часто развиваются хронические формы, которые приводят к разрушению клеток печени.

Исходом гепатита С становятся цирроз или рак печени. Для выявления маркеров заболевания в первую очередь назначают иммуноферментный анализ – ИФА на гепатит С.

Что такое ИФА?

Анализ основан на способности специфических антител (белков крови) связываться с антигеном (частицами вируса), при этом один из них «помечен» ферментом. Образовавшийся комплекс реагирует с подкрашенным субстратом, что фиксируется спектрофотометрическими методами.

Иммуноферментный анализ (ИФА) на гепатит С показывает не присутствие самого вируса-возбудителя в крови, а ответ иммунной системы на столкновение с ним. Количество вируса в крови на момент проведения ИФА может быть ничтожно мало, за порогом определения. А антитела – иммуноглобулины, которые выработались при встрече с «агрессором», продолжают циркулировать в кровеносной системе.

Именно присутствие антител определяется при ИФА. Появляются они в срок от нескольких дней до нескольких недель после заражения гепатитом С.

ИФА выявляет циркулирующие иммуноглобулины даже в малой концентрации. По их типу можно судить о давности заболевания. В острый период, когда вирус гепатита активно размножается, определяют иммуноглобулины класса М.

В хронической стадии (спустя 6 мес. от начала заболевания) при ИФА обнаруживают иммуноглобулины класса G. Последний тип также может свидетельствовать не о хронизации процесса, а о самом факте столкновения иммунной системы с вирусом гепатита С в прошлом.

Показания к ИФА на гепатит С

Обследование на маркеры гепатита С, к которым относятся антитела – иммуноглобулины, давно стала рутинной процедурой. ИФА назначают при:

• острых и хронических заболеваниях печени;

• желтухе неясного генеза;

• обследовании перед хирургическими вмешательствами;

• стандартном обследовании доноров крови;

• постановке на учет в женской консультации при беременности. Повторно анализ сдают за 2-4 недели до предполагаемой даты родов;

• прохождении гемодиализа;

• профилактических осмотрах медработникам, контактирующим с компонентами крови и другими биологическими жидкостями;

• незащищенном сомнительном половом контакте;

• рождении детей от инфицированных матерей.

В порядке рекомендаций анализ на гепатит С назначают родственникам больного, близко с ним контактирующим. В 50% случаев парентеральный источник заражения выявить не удается. Инфекционисты предполагают бытовой путь передачи, когда зараженная кровь может попадать в кровоток здорового человека через кожные ранки и трещины. У этой версии много противников.

Как проводится анализ?

За 48 часов до ИФА исключают из пищи алкоголь, жареное, жирное и соленое. За 12 часов до забора крови из вены пациенту необходимо воздержаться от приема каких-либо лекарств. Анализ сдают утром натощак.

Наибольшее распространение получил «твердофазный» ИФА. Твердая фаза – это материал, на котором фиксируют антитела или антигены. В этом качестве используют мембраны, активно собирающие на себя белки (лабораторные планшеты, стенки пробирки, шарики и бусины из полипропилена или поливинилхлорида, нитроцеллюлозу и пр.).

Вне зависимости от разновидности ИФА, в его проведении существует строгая этапность:

1. На первой стадии исследуемый материал «узнается» специфическим антителом и связывается с ним, образуя иммунный комплекс;
2. На второй стадии с образовавшимся иммунным комплексом реагирует помеченный ферментом так называемый конъюгат – антитело или антиген;
3. Заключительная стадия ИФА позволяет уловить и зарегистрировать сигнал от ферментной метки.

Виды ИФА

Вариантов выполнения анализа достаточно много. Их классифицируют:

• По типу реагентов, используемых на первом этапе ИФА:
  a) конкурентный;
  b) неконкурентный;

• По степени однородности среды, в которой происходят реакции ИФА:
  a) гомогенные;
  b) гетерогенные;

• 3) По принципу определения исследуемого вещества:
  a) прямой;
  b) непрямой. Именно непрямой метод ИФА используется при выявлении маркеров гепатита С.

Прямой метод ИФА

При этом методе используют стандартные антитела к вирусу гепатита С, помеченные меткой – ферментом.

1. В лунки лабораторного планшета (если выбрали именно его в качестве твердой фазы) помещают сыворотку крови пациента. Выдерживают 20 минут, чтобы антигены (белки вируса гепатита С) успели прикрепиться к стенкам.
2. Добавляют стандартные помеченные ферментом антитела к гепатиту С. Выдерживают еще несколько часов – за это время образуются иммунные комплексы антиген-антитело с меткой. Чем больше антигенов в исследуемой сыворотке, тем больше таких комплексов образуется.
3. Содержимое лунок промывается от несвязанных белков. Затем добавляют субстрат. Это вещество при реакции с ферментом-меткой меняет цвет. Чем больше комплексов при ИФА образовалось, тем большее количество фермента может воздействовать на субстрат и тем ярче хроматографическая реакция. Она считывается ИФА-ридером и оценивается количественно.

Непрямой метод

При этом методе ИФА стандартный антиген связывается с антителами сыворотки пациента. К образовавшемуся иммунному комплексу добавляют меченые ферментом стандартные антитела к иммуноглобулинам.

1. В лунки лабораторного планшета помещают стандартный антиген гепатита С (частички вируса). Антиген прикрепляется к стенке, незакрепленные белки вымываются лаборантом.
2. В подготовленные таким образом лунки помещают исследуемый материал (сыворотку крови), инкубируют. Есть обязательные контрольные лунки со стандартными реагентами. За время инкубации образуются комплексы антиген-антитело. Непрореагировавшие компоненты опять вымывают.
3. В лунки добавляют меченые ферментом антитела к иммуноглобулинам М и G. Эти белки прореагируют с образовавшимся ранее комплексом, только если в исследуемом образце есть антитела к гепатиту С. Промывают.
4. Добавляют еще один компонент – субстрат. Это химическое соединение разрушается ферментом из комплекса антиген-антитело. При этом образуется окрашенное вещество, количество которого фиксируют специальным прибором – ИФА-ридером. Чем больше фермента, тем сильнее он прореагирует с субстратом и тем ярче будет цветовой сигнал.

Расшифровка результатов

Высокая чувствительность ИФА иногда играет с пациентом злую шутку. Не каждый положительный результат означает заболевание и не каждый отрицательный – гарантия свободы от вируса.

При положительном ИФА определяют генотип вируса и определяют количество циркулирующих в крови вирусов с помощью ПЦР (полимеразной цепной реакции).

Положительный

При ИФА выявляют маркеры острой фазы заболевания (иммуноглобулины класса М (IgM)) и иммуноглобулины класса G (IgG). Последние могут означать, что у пациента хронический гепатит С или то, что иммунная система хотя бы раз в прошлом сталкивалась с этим вирусом и выработался иммунитет.

Выявление одновременно двух типов иммуноглобулинов при ИФА говорит об обострении хронического гепатита С.

Отрицательный

Самый вероятный вариант – пациент не болен и его иммунная система никогда не сталкивалась с вирусом.

Псевдоотрицательный результат при ИФА можно получить в том случае, если пациент инфицировался относительно недавно и защитные антитела просто не успели выработаться. Это так называемое «диагностическое окно». Его срок – 6 месяцев.

Наконец, нельзя полностью исключить ошибку лаборатории.

Ложноположительный

ИФА реже дает погрешности по сравнению с ПЦР. Тем не менее, исследуемые вещества – белки. Реагент может связаться с неспецифическим белком сыворотки крови. Ложноположительный ИФА на гепатит С нередок в случаях:

• выполненной накануне вакцинации;

• при аутоиммунных патологиях или туберкулезе, рассеянном склерозе, склеродермии;

• опухолевом процессе;

• инфекциях, протекающих с гипертермией (грипп, ОРЗ и пр.).

Грешат ложноположительными результатами исследования на маркеры гепатита С у беременных. Довольно часто ИФА дает ложное заключение о наличии антител пациентам со II группой крови.

ИФА положительный, а ПЦР отрицательный: что это значит?

Полимеразная цепная реакция выявляет присутствие вируса в крови и его количество, помогает определить генотип. ИФА «видит» антитела – клетки, вырабатываемые спустя какое-то время после инфицирования и остающиеся в организме после уничтожения «врага».

Вариантов, при которых у пациентов с гепатитом С ПЦР отрицательный, а ИФА – положительный, два. Самый вероятный – сформировался иммунитет к вирусу, а сам он уничтожен иммунной системой или лекарствами.

Второй: нельзя исключить ошибку лаборатории при проведении ПЦР.

Диагностикой заболеваний должен заниматься врач. Он учитывает все нюансы обследования. А лабораторная диагностика, в том числе ИФА – только вспомогательный метод, не лишенный погрешностей.

Содержание

1. ИФА
2. ПЦР
3. Клинический анализ крови
4. Биохимический анализ крови
5. Функциональные пробы
6. Другие анализы
7. Когда сдавать анализы
8. Подготовка к сдаче анализов

Гепатит С — серьезная патология, передающаяся через кровь. Как правило, заболевание протекает бессимптомно, лишь на поздней стадии человек узнает, что заражен. Клетки печени к этому времени уже значительно повреждены. Выявить заболевание на ранней стадии помогут анализы на гепатит С.

На сегодняшний день есть множество маркеров, при помощи которых можно провериться на наличие гепатита. Но самостоятельно все выяснить будет сложно, обязательно понадобится консультация специалиста, который поможет определить, какие именно тесты необходимо пройти и как расшифровать их результаты.

ИФА

Первый анализ на гепатит, позволяющим определить наличие антител в крови и, таким образом, подтвердить контактирование человека с вирусом, называется ИФА. С его помощью выявляются анти HCV.

Эти анализы крови на гепатит показаны в первую очередь пациентам перед операцией, беременным женщинам и донорам.

Есть 2 класса гепатита С — иммуноглобулин M и G. При обобщении результатов складываются суммы антител этих классов, что дает возможность распознать у пациента острое либо хроническое заболевание. Показатели этого анализа могут быть ложноотрицательными либо ложноположительными. Это характерно для беременных женщин и пациентов со второй группой крови и не является отклонением от нормы.

Причинами ложного результата также могут быть:

1. Прием некоторых лекарственных препаратов.
2. Выработка антител при контакте с вирусом. Спустя какое-то время возможно повреждение вирионов, но антитела еще будут оставаться в организме.
3. Вакцинация.
4. Туберкулез, склеродермия, малярия, рассеянный склероз, грипп.
5. Ошибки во время проверки крови.
6. Аутоиммунные патологии.
7. Новообразования.

Отрицательный результат означает, что у человека никогда не было гепатита, однако последние 6 месяцев остаются под вопросом. При заражении в этот период антитела еще не успели образоваться и в результатах обследования не отразятся.

При положительном анализе крови на гепатит есть подозрение на контакт с вирусом, т.к. при появлении инфекции организмом вырабатываются антитела анти HCV. Затем устанавливается, находится ли заболевание в хронической форме или пациент переболел и выздоровел (наличие антител обусловлено перенесенной патологией). Для этого проводятся еще некоторые исследования. При этом, согласно статистике, лишь 20% всех зараженных вирусом гепатита С выздоравливают сами, у оставшихся 80% патология переходит в хроническую форму. Этим и обусловлено наличие антител к HCV.

Однако иногда положительный анализ не свидетельствует о гепатите С. В таких случаях речь идет о ложноположительном результате. Для подтверждения положительного результата анализы необходимо сдать три раза. К сдаче биоматериала необходимо подготовиться:

• отказаться от спиртного;
• отказаться от курения хотя бы за час до сдачи крови;
• сдавать кровь только при нормальной температуре тела;
• не заниматься спортом перед забором крови;
• предупредить лаборанта об употреблении лекарственных средств или наличии заболеваний.

Сдать кровь на анализ сегодня можно практически в любом медицинском учреждении, однако делать это лучше всего в проверенных лабораториях.

При положительном результате анализа ИФА на выявление анти HCV гепатита С делается ПЦР РНК диагностика, считающаяся самым точным методом для обнаружения патологии.

ПЦР

Метод ПЦР используется с целью обнаружения РНК патогена. Это самый распространенный метод диагностирования гепатита С. Наличие антител HCVcor IgG NS3-NS5 необходимо для опровержения или подтверждения диагноза при отрицательном показателе при ПЦР.

ПЦР является самым точным методом, при помощи которого можно обнаружить инфекцию уже на пятый день после инфицирования. ПЦР помогает выявить генотип вируса и установить скорость развития болезни. Результат анализа с применением ПЦР бывает:

• Количественным — показывает скорость развития патологии по количеству вирусов на 1 кубический см биоматериала.
• Качественным – низкий показатель концентрации клеток свидетельствует об отрицательном результате.

Показатели нормы при анализе на гепатит зависят от применяемого реагента. Вирусная нагрузка делается во время лечения гепатита С. При снижении показателей можно считать, что лечение эффективно.

Клинический анализ крови на гепатит

С помощью общего развернутого клинического анализа определяется содержание гемоглобина в крови и количество:

• СОЭ;
• эритроцитов;
• лимфоцитов;
• лейкоцитов;
• тромбоцитов.

ОАК показывает отклонения от показателей нормы. При прогрессировании патологии у пациента ухудшается свертываемость крови и усиливается кровоточивость. Показатель СОЭ увеличивается.

Биохимический анализ крови

Данный анализ оценивает не только состояние печени, но и остальных органов. Он выявляет особенности метаболизма пациента и потребность организма в микроэлементах. Биохимия устанавливает ГГТП, АСТ, амилазу крови, АЛТ, общий белок, щелочную фосфатазу, билирубин.

Функциональные пробы

При помощи функциональных проб оценивается работоспособность печени и определяются значения:

• свертываемости крови;
• белковых фракций;
• общего белка;
• альбумина.

Другие анализы

Кроме вышеперечисленных, пациенту назначают и другие исследования. Так, проводятся тесты на ВИЧ и другие вирусные гепатиты и аутоиммунные патологии.

Также определяется стадия гепатита и его активность. Для этого необходимы следующие исследования:

1. Фибросканирование печени. Применяется чаще других методов диагностики.
2. Биопсия печени. Распознается очаг поражения печени, определяется разрастание в тканях. На сегодняшний день есть тесты, помогающие установить уровень поражения печени, получить сведения о воспалительном процессе и т.д.
3. УЗИ. При гепатите С УЗИ позволяет выявить динамику развития болезни. На первой стадии патологии при помощи УЗИ можно увидеть увеличение печени и новообразования.
4. Обследование щитовидной железы. Щитовидка исследуется посредством УЗИ, берутся анализы на выявление антител к тиреоглобулину и тиреопероксидазе, устанавливается количество гормонов трийодтиронина (Т3), тироксина (Т4), тиреотропного гормона. Эти тесты следует проводить при необходимости лечения с применением рибавирина и интерферона, софосбувира.

Вопрос о целесообразности проведения того или иного исследования решает врач после осмотра пациента.

Рекомендуемые товары

Когда сдавать анализы на гепатит

Результаты анализа на гепатит С будут готовы в течение 1-5 рабочих дней. Но, как правило, их можно получить уже на следующий день после сдачи крови. В таблице перечислены тесты и частота их проведения у пациентов, не проходящих противовирусную терапию.

Подготовка к сдаче анализов

Больному следует правильно подготовиться к сдаче крови. Это позволит избежать сомнительного результата. Пациенту нужно отказаться от занятий физкультурой, употребления спиртного, не курить минимум за час до сдачи анализа, исключить стресс. За 2-3 дня до обследования нужно нельзя есть жареную, жирную и острую еду.

Ужин должен быть легким, после него нельзя есть, можно пить лишь воду, т.к. кровь на гепатит сдают натощак. В ночь перед анализом следует лечь спать в привычное время и встать не позже, чем за час до забора крови.

Расшифровку анализа готовит врач. Только специалист может подтвердить или опровергнуть присутствие в организме вируса.