Иммуноферментного анализа крови в инвитро

Определение специфических антител класса IgМ к коронавирусу SARS-CoV-2 – возбудителю тяжелого острого респираторного синдрома (COVID-19). 

Новый коронавирус SARS-CoV-2 относится к семейству РНК-содержащих вирусов семейства Coronaviridae, линии Beta-CoV B. 

Основным источником инфекции является больной человек, в том числе находящийся в инкубационном периоде заболевания. 

Передача инфекции осуществляется воздушно-капельным, воздушно-пылевым и контактным путями. Ведущим путем передачи SARS-CoV-2 является воздушно-капельный, который реализуется при кашле, чихании и разговоре на близком (менее 2 метров) расстоянии. Контактный путь передачи осуществляется во время рукопожатий и при других видах непосредственного контакта с инфицированным человеком, а также через пищевые продукты, поверхности и предметы, контаминированные вирусом. 

Инкубационный период составляет от 2 до 14 суток, в среднем 5-7 суток. 

Диагноз устанавливается на основании клинического обследования, данных эпидемиологического анамнеза, результатов инструментальных и лабораторных исследований. 

Наиболее частыми клиническими симптомами данной инфекции являются: повышение температуры тела, кашель (сухой или с небольшим количеством мокроты), одышка, утомляемость, ощущение заложенности в грудной клетке. 

Рекомендованным методом специфической лабораторной диагностики является выявление РНК SARS-CoV-2 методом ПЦР. 

Иммуноглобулины класса M (IgM) – ранние антитела, которые начинает вырабатывать иммунная система в ответ на инфекцию SARS-CoV-2. Их уровень обычно становится доступным для обнаружения не ранее 1-2 недель от контакта с возбудителем (не ранее 5 дней от появления симптомов при симптоматическом течении), а общий период вероятного выявления антител класса M чаще составляет менее 2-3 месяцев – в течение этого времени IgM антитела постепенно полностью сменяются на IgG. Обнаружение IgM, таким образом, может указывать на недавнее инфицирование SARS CoV-2. Однако, результат этого теста сам по себе не может служить основанием для диагностических заключений. Уровень антител и динамика антительного ответа могут индивидуально варьировать.

У лиц с иммуносупрессией уровень антител при инфекции может быть на недетектируемом уровне. В редких случаях возможны ложноположительные результаты вследствие перекрестных реакций или иных индивидуальных сывороточных интерференций.

Литература

Определение активности комплемента применительно к классическому, альтернативному и лектиновому путям (раздельно) применяют для скрининга врожденного иммунодефицита. 

Комплемент был открыт как термолабильный бактерицидный фактор сыворотки. В современном представлении система комплемента – это сложная система белков сыворотки крови, способных к каскадной активации, включенная в механизмы иммунной защиты и удаления из организма чужеродных клеток, микроорганизмов, продуктов клеточной гибели. Комплемент играет важнейшую роль в обеспечении сопротивляемости инфекциям и поддержании гомеостаза. В организме эта система находится под контролем присутствующих в биологических жидкостях или ассоциированных с мембранами регуляторов. Однако она может быть быстро мобилизована и усилена при необходимости немедленной иммунной реакции на патогенное воздействие. 

Активация системы комплемента происходит в виде каскадной реакции, которая может осуществляться тремя путями с разными механизмами инициализации (классическим, альтернативным и лектиновым) и общим конечным этапом (Рис.1.). Несоответствующая активация комплемента может вести к хроническому воспалению и повреждению тканей. 

Классический путь активации комплемента инициируется комплексами антиген-антитело и агрегированными иммуноглобулинами. Активация альтернативного и лектинового (маннозного) путей не зависит от присутствия антител, индуцируется контактом с определенными структурами бактериальной стенки или иной чужеродной поверхности. Три пути тесно взаимодействуют и сходятся на конечном этапе, что сопровождается формированием опсонинов, анафилотоксинов, хемоаттрактантов и мембраноатакующего комплекса, обеспечивающих эффективный воспалительный и цитолитический ответ на патоген.

Рисунок 1. Схема участия компонентов комплемента в классическом, альтернативном, лектиновом механизмах инициализации и общем конечном пути активации

Каждый из указанных путей активации комплемента может быть задействован не только в механизмах естественной иммунной защиты, но и в патогенезе ряда заболеваний. Дефицит любого из компонентов комплемента приводит к снижению сопротивляемости организма и рецидивирующим инфекциям или несоответствующему воспалительному ответу. Непрерывная патологическая активация комплемента может приводить к повреждению здоровых тканей. Определенные дефекты системы комплемента предрасполагают к развитию аутоиммунной и иммунокомплексной патологии (системной красной волчанки (СКВ), нефритов). 

Недостаточность комплемента может быть не только причиной, предрасполагающей к повторным инфекционным заболеваниям и развитию аутоиммунной патологии, но и следствием заболеваний, протекающих с выраженной активацией комплемента. В процессе развития многих инфекционных и аутоиммунных заболеваний происходит повышенное потребление факторов комплемента. Это обнаруживается при лабораторных исследованиях в виде уменьшения концентрации вовлеченных компонентов и снижения функциональной активности соответствующего пути активации комплемента. 

Врожденные гомозиготные дефициты компонентов комплемента крайне редки, гетерозиготные (с отсутствием одного аллеля) отмечаются чаще и сопровождаются низким уровнем соответствующих факторов комплемента и снижением его функциональной активности. Приобретенная недостаточность комплемента более распространена. В том числе, как следствие усиленного потребления комплемента в течение иммуновоспалительного процесса или аутоиммунного заболевания. 

Предлагаемое исследование комбинирует общие принципы, применяемые в гемолитических методах оценки функции системы комплемента, с использованием иммуноферментного способа распознавания неоантигена мембраноатакующего комплекса, продуцируемого в результате активации системы комплемента. Скрининговое исследование применяется для обследования пациентов при подозрении на врожденный дефицит комплемента либо заболевания, протекающие с потреблением комплемента. С учетом результатов теста дальнейшее обследование пациента при подозрении на врожденный дефицит комплемента может быть нацелено на идентификацию вероятного дефицитного компонента (Таб. 1., раздел «Интерпретация»).

Литература

1. Лапин С.В., Тотолян А.А. Иммунологическая лабораторная диагностика аутоиммунных заболеваний. — СПб.: Изд. «Человек». 2010.  
2. Клиническое руководство Тица по лабораторным тестам (под ред. А. Ву). — М.: Изд. «Лабора». 2013:1280. 
3. Glovsky M.M. et al. Complement determinations in human disease. Annals of Allergy, Asthma, and Immunology. 2004;93:513-523. 
4. Nilsson B., Ekdahl K.N. Complement Diagnostics: Concepts, Indications, and Practical Guidelines. Clinical and Developmental Immunology. 2012;2012;11. 
5. Материалы фирмы-производителя реагентов.

Скрининговая оценка состояния различных звеньев иммунитета, используемая в диагностике первичных и вторичных иммунодефицитов, аутоиммунных, лимфопролиферативных, инфекционных, гематологических заболеваний. 

В состав профиля входят следующие показатели:

1. Лимфоциты , абсолютное значение
2. Субпопуляции лимфоцитов:

• Т-лимфоциты (CD3+)
• Т-хелперы (CD3+CD4+)
• Т-цитотоксические лимфоциты (CD3+CD8+)
• Иммунорегуляторный индекс (CD3+CD4+/CD3+CD8+)
• В-лимфоциты (СD19+)
• ЕК-клетки (CD3-CD16+CD56+)
• Т-ЕК-клетки (CD3+CD16+CD56+)
• Активированные Т-лимфоциты (CD3+HLA-DR+)
• Активированные клетки, не относящиеся к Т-лимфоцитам (В-лимфоциты и активированные ЕК) (CD3-HLA-DR+)

• Т-лимфоцитов (CD3+CD69+)
• В- и ЕК-лимфоцитов (СD3-CD69+)

• Фагоцитоз (гранулоциты)
• Фагоцитоз (моноциты)

• IgG
• IgA
• IgM
• IgE

Основные субпопуляции лимфоцитов:

Т-лимфоциты – лимфоциты, созревание которых происходит в тимусе (отсюда их название). Они контролируют работу В-лимфоцитов, ответственных за образование антител, т. е. за гуморальный иммунный ответ.

Т-хелперы, Th (от англ. to help – помогать) – разновидность Т-лимфоцитов, несут на своей поверхности структуры, способствующие распознаванию антигенов, презентированных вспомогательными клетками, участвуют в регуляции иммунного ответа, вырабатывая различные цитокины.

Цитотоксические Т-клетки — распознают фрагменты антигена, на поверхности клеток-мишеней, ориентируют свои гранулы по направлению к мишени и высвобождают их содержимое в области контакта с ней. При этом некоторые цитокины являются сигналом гибели (по типу апоптоза) для клеток-мишеней.

В-лимфоциты (от лат. «bursa» — сумка по названию сумки Фабрициуса, в которой созревают эти лимфоциты у птиц) проходят развитие в лимфоузлах и других периферических органах лимфоидной системы. На поверхности эти клетки несут иммуноглобулины, функционирующие как рецепторы к антигенам. В ответ на взаимодействие с антигеном В-лимфоциты отвечают делением и дифференциацией в плазматические клетки, вырабатывающие антитела, посредством которых обеспечивается гуморальный иммунитет.

ЕК-клетки (естественные клетки-киллеры) или натуральные киллеры-клетки с естественной, неиммунной цитотоксической активностью к неопластически изменённым клеткам-мишеням, которые не относятся ни к зрелым Т- или В-лимфоцитам, ни к моноцитам.

Т-ЕК-клетки (ЕКТ) – клетки с естественной неиммунной киллерной активностью, имеющие признаки Т-лимфоцитов.

Активированные лимфоциты.

HLA-DR – один из антигенов MHC класса II (major histocompatibility complex — главный комплекс гистосовместимости), участвующих в презентации потенциально чужеродных антигенов, что необходимо для формирования адекватного иммунного ответа. При иммунофенотипировании может быть использован в качестве маркёра активированных клеток. CD3+HLA-DR+ — клетки, представляющие собой зрелые активированные Т-лимфоциты человека. CD3-HLA-DR+ — активированные клетки, не относящиеся к Т-лимфоцитам (В-лимфоциты и активированные ЕК).

Способность лимфоцитов к активации.

Способность лимфоцитов к активации в данном тесте оценивают по содержанию лимфоцитов, экспрессирующих CD69 в ответ на инкубацию в присутствии ФГА (митоген растительного происхождения). CD69 (другие названия — activation inducer molecule, AIM; early activation antigen, EA-1) – ранний маркёр активации, трансмембранный белок типа I. Этот белок вовлечен в ранние механизмы активации Т-клеток, ЕК-клеток, В-клеток, моноцитов и тромбоцитов.

Фагоцитарная активность лейкоцитов.

Данные по фагоцитарной активности нейтрофилов и моноцитов (относительное содержание клеток, фагоцитировавших добавленные к пробе при инкубации меченые флюоресцентной меткой бактерии) позволяют оценить резервные возможности этих клеток по поглощению и перевариванию чужеродных агентов.

Циркулирующие иммунные комплексы общие (ЦИК)

Одновременное присутствие высоких концентраций антигенов и их специфических антител может вести к образованию циркулирующих иммунных комплексов. Иммунные комплексы могут выходить из кровотока в мелких сосудах и откладываться в тканях, например, в гломерулах почек, в лёгких, коже, суставах, стенке сосудов. ЦИК обладают способностью связывать и активировать комплемент, что ведёт к повреждению ткани. Повышение уровня ЦИК может наблюдаться при аутоиммунных заболеваниях, хронических инфекционных заболеваниях, при которых постоянная продукция антигена инфекционным агентом сочетается с иммунным ответом на него (хронические гепатиты). Клинически это часто проявляется гломерулонефритами, артритами, нейропатиями. Несмотря на непосредственную роль в патогенезе некоторых заболеваний, определение ЦИК не всегда информативно, поскольку количество иммунных комплексов, отложившихся в тканях более важно, чем количество комплексов, циркулирующих в крови. Исследование ЦИК может быть недостаточно чувствительным и специфичным в диагностике болезней, вызываемых иммунными комплексами, и должно дополняться исследованием эффектов ЦИК на функцию органов (например, концентрация креатинина и анализ мочи), а также определением С3 С4 компонентов комплемента (см. тест 

№ 193

), количество которых снижается вследствие усиленного потребления.

Данные иммунологического исследования интерпретирует врач-иммунолог в комплексе со всеми клинико-анамнестическими данными конкретного пациента. При оценке иммунного статуса пациента результаты исследования оценивают с точки зрения природы и стадии патологического процесса, сопутствующих заболеваний, приёма лекарственных препаратов и пр. При этом важны не только абсолютные значения отдельных показателей, но и их соотношение и динамика показателей. Изменения иммунологических показателей могут быть проявлением нормальной реакции организма на воздействие физиологических или патологических факторов (с различной картиной сдвигов на разных стадиях заболевания), отражать чрезмерную активацию, истощение иммунной системы, характеризовать врождённый или приобретённый дефект отдельных звеньев иммунной системы.

Литература

1. Зурочка А.В., Хайдуков С.В. и др. — Проточная цитометрия в медицине и биологии. – Екатеринбург: РИО УрО РАН, 2013. – 552 с.
2. Клиническая иммунология и аллергология / Ред. Лолор-младший Г., Фишер Т, Д. Адельман Д../: Пер. с англ. — М.: Практика, 2000. — 806 с. 
3. Клиническая лабораторная диагностика. Национальное руководство. Том 2./Ред. Долгов В.В., Меньшиков В.В./ – М., ГЭОТАР-Медиа, 2012 – 808 с. 
4. Практическое руководство по детским болезням. Том 8 Иммунология детского возраста. /Ред. А.Ю.Щербина, Е.Д.Пашанов/ — Москва: МЕДПРАКТИКА, 2006 — 432 с. 
5. Ройт А., Бростофф Д., Дейл Д. Иммунология. — М.: Мир, 2000 — 592 с 
6. Ярилин А. А. Иммунология. – М.: ГЭОТАР-Медиа. 2010 — 752 с. 
7. Leach М., Drummond М., Doig A. Practical Flow Cytometry in Haematology Diagnosis Hardcover. – WILEY-BLACKWELL, 2013. 
8. Tietz Clinical guide to laboratory tests. 4-th ed. Ed. Wu A.N.B. – USA: W.B Sounders Company, 2006 — 1798 p.