Флуоресцентный метод анализа сыворотки крови
Иммунофлуоресцентный анализ (МФА — метод флуоресцирующих антител, иммунофлуоресценция) (англ. Immunofluorescence) — набор иммунологических методов для качественного и количественного определения поверхностных и внутриклеточных антигенов в образцах клеточных суспензий (культур клеток, бактерий, микоплазм, риккетсий, вирусов), образцов крови, костного мозга, альвеолярных смывов, тонких тканевых срезов. Метод позволяет детально анализировать биологические образцы на присутствие определенных антигенных детерминант, характерных для определенных возбудителей или заболеваний, проводить количественную оценку как поверхностных так и внутриклеточных белков и рецепторов. Исследование и оценка может выполняться вручную при помощи флюоресцентного микроскопа или автоматизировано с использованием проточного цитометра (flow cytometer) или микрочипового цитометра (сhip cytometer). Возможно применение конфокального микроскопа и роботизированного флюоресцентного микроскопа (в том числе совмещенных с проточным цитометром) в сочетании с программной системой обработки изображений. Имеющиеся в настоящее время автоматизированные технологии позволяют анализировать в одном образце примерно 50 различных антигенов с использованием набора различных флюоресцентных маркеров в формате высокоинформативной микроскопии и цитометрии (методы носят названия high-content imaging, high-content cytometry, high-content screening) и примерно вдвое меньшем максимальным набором антигенов с использованием современной проточной цитометрии или конфокальной микроскопии. Основными практическими приложениями являются онкология, микробиология, клеточная биология, генетика, фармакология и др.
Сущность и классификация метода[править | править код]
Сущность метода заключается в визуализации антигена специфическими антителами с флуоресцентными маркерами. Метод конъюгации глобулинов с органическими флюорохромами разработан в 1942 году А. Кунсом (англ.)русск..[1] В настоящее время метод использует как антитела к различным антигенам, так и специфические красители к ДНК (к примеру DAPI), РНК (к примеру Sybr Green II), липидам и белкам.
В базовой МФА методике различают прямой метод, разработанный А. Кунсом и Мелвином Капланом,[2] и непрямой, разработанный А. Кунсом и Уиллером в первоначальном варианте непрямого МФА с комплементом.
При прямом методе (пМФА) на исследуемый препарат или в суспензию клеток наносят раствор прямо меченых флюоресцентным красителем антител. Образование комплекса антиген-антитело обнаруживается флюоресцентным сигналом в виде свечения разной степени интенсивности и четкости.
При непрямом методе (нМФА) на препарат наносят антитела против искомых антигенов (т. н. «первые» антитела), а затем видоспецифичные «вторые» антитела против «первых» антител, что позволяет избежать неспецифических реакций. При этом только вторые антитела коньюгированны с флюоресцентным красителем. К примеру, если при исследовании в качестве «первых» антител используются мышиные антитела — mouse IgG, то в качестве «вторых» используются антивидовые anti-mouse IgG коньюгированные с флюоресцентным красителем. Комплекс антиген-антитело дает флюоресцентное окрашивание только после связывания со «вторым» антителом.
Непрямые методы требуют наличия только антиглобулиновых видовых сывороток с флюорохромами, но при этом необходимо большое количество тестовых контролей. При постановке прямым методом делается только один контроль, хотя в более ранних версиях метода требовалось множество моноспецифических сывороток. Долгое время недостатками прямых видов МФА являлись ограниченная чувствительность из-за наличия возможных перекрестных реакций между близкими по антигенному составу объектами и неспецифическая флуоресценция вследствие адсорбции флуоресцирующих глобулинов на различных элементах препарата. В настоящее время используются коммерческие стандартные конъюгаты, содержащие иммуноглобулины к исследуемым антигенам. Использование биоинженерных иммуноглобулинов и высокая степень очистки антител позволили практически свести на нет неспецифические реакции, что сделало возможным дальнейшее технологическое развитие метода.
Поскольку прямой метод в настоящее время позволяет избежать неспецифических реакций, автоматизированные методики преимущественно используют прямой метод иммунофлуоресценции.
Результаты ручной микроскопической оценки описываются в так называемых «крестах» (от одного + до четырёх ++++) — субъективная градация степени выраженности реакции глазом исследователя. В автоматизированных методах в качестве детектора используются фотоумножители или высокочувствительные флуоресцентные фотокамеры, что позволяет регистрировать сигнал с большой точностью и дает значение относительного уровня флюоресценции (relative fluorescence ratio) в широком диапазоне шкалы. Абсолютное значение высчитывается с помощью контролей или антигенов с известным постоянным содержанием в образце. При использовании автоматизированных методов обработка данных осуществляется специализированными программами для обработки изображений и анализа цитометрических данных.
Значение и перспективы метода[править | править код]
Метод имеет решающее значение в ранней диагностике и лечении онкологических заболеваний (иммуногистохимия, онкогематология), диагностике инфекционных заболеваний (например определение CD4+ клеток при ВИЧ) и наследственных синдромов. Интенсивно развиваются автоматизированные методы, среди которых направления высокоинформативной микроскопии (high content imaging) и высокоинформативной цитометрии(high content cytometry),параллельно развивающиеся с 90х годов комбинированные методики цитометрии-микроскопии (цитометр-микроскоп), а также методы микрочиповой цитометрии с плазмонной голографией [3] в которых отдельные антитела метятся наночастицами.
Примечания[править | править код]
- ↑ A. H. Coons, H. J. Creech, R. N. Jones, E. Berliner (нем.)русск., The demonstration of pneumococcal antigen in tissues by the use of fluorescent antibody, J. Immunol. 45, 1942, pp. 159—170
- ↑ A. H. Coons, M. H. Kaplan, Localization of antigen in tissue cells. II. improvements in a method for the detection of antigen by means of fluorescent antibody, J. Exp. Med., 91(1), pp. 1-13
- ↑ On-Chip Cytometry using Plasmonic Nanoparticle Enhanced Lensfree Holography : Scientific Reports : Nature Publishing Group
Источник
Люминесцентный, или флуоресцентный, метод анализа основан на измерении интенсивности излучаемого веществами видимого света (флуоресценции) при облучении их ультрафиолетовыми лучами. [c.28]
Количественный флуоресцентный метод анализа основан на измерении интенсивности флуоресценции искомого вещества путем сравнения его с интенсивностью флуоресценции вещества с известной концентрацией. Для оценки интенсивности флуоресценции наибольшее применение нашли визуальный и фотометрический методы. Вследствие того что выход флуоресценции зависит от ряда факторов, подготовку пробы и измерение интенсивности флуоресценции необходимо вести в строго определенных условиях. [c.117]
АТОМНО-ФЛУОРЕСЦЕНТНЫЙ МЕТОД АНАЛИЗА [c.130]
Очень эффективным оказалось применение рентгеновского флуоресцентного метода в анализе космических объектов. С помощью спектрометрической аппаратуры РИФМА (рентгеновский изотопный флуоресцентный метод анализа), установленной на Луноходе-1 , было определено содержание основных породообразующих элементов непосредственно на поверхности Луны. Для возбуждения флуоресцентного излучения применялись радиоактивные источники, характеризующиеся высокой стабильностью и не нуждающиеся в электрической энергии. В качестве детектора использовались пропорциональные счетчики. Электрический импульс счетчика преобразовывался и по радио передавался на Землю. [c.132]
Люминесцентный, илн флуоресцентный, метод анализа и др. [c.224]
Не надо думать, что на сегодняшний день все проблемы аналитической химии решены с применением в атомно-флуоресцентном анализе лазерных источников возбуждения. Несмотря на достигнутые очень хорошие пределы обнаружения элементов для реальных образцов, проблемы атомизации пробы, стабильности лазерных источников, технической эксплуатации лазеров, дезактивации возбужденных состояний и т. п. не позволяют еще считать атомно-флуоресцентный метод анализа наиболее широко применяемым методом для решения всех возникающих задач. [c.133]
Важным элементом аппаратурного оформления является также выбор атомизатора, поскольку шум самого атомизатора (его термическое излучение) имеет первостепенное значение при атомно-флуоресцентном методе анализа. [c.133]
В атомно-флуоресцентном методе анализа погрешность метода, определяемая совокупностью его случайной и систематической погрешностей, в ряде случаев составляет 1—2% и обычно не превышает 10%. [c.137]
В аналитической спектроскопии в названиях различных методов, как правило, отражены объекты исследования и процессы, лежащие Р) основе определения этих объектов, например атомно-абсорбционный, атомно-флуоресцентный методы анализа. В методе, основанном на селективной лазерной ионизации, объектом исследований являются атомы, а процессы, позволяющие детектировать эти атомы, связаны с образованием ионов. Поэтому, с точки зрения авторов настоящего учебного пособия, данный метод логично называть в общем виде атомно-ионизационным (АИ). [c.183]
Получение и исследование ферритовых пленок в значительной мере тормозится из-за отсутствия эффективных методов контроля состава и толщины выращиваемых различными способами пленок. В настоящей работе предпринята попытка использовать для определения состава и толщины пленок кобальтового феррита рентгеноспектральный флуоресцентный метод анализа. [c.172]
Когда говорят о люминесцентном (или о флуоресцентном) методе анализа, под этим обычно понимают фотолюминесценцию. Различают обычно две группы методов анализ по непосредственному наблюдению люминесцирующего материала и анализ, основанный на переведении определяемого компонента в люминесцирующее соединение. Вторая группа методов люминесцентного анализа близка к фотометрическому анализу. Известно немало случаев, когда один и тот же реактив может быть применен для определения одного и того же элемента как фотометрическим, так и люминесцентным методом. В обоих случаях необходимо перевести определяемый компонент в соединение, которое, возможно, более сильно поглощает свет. При фотометрическом анализе измеряют непосредственно ослабление интенсивности светового потока. Для люминесцентного же анализа эту реакцию можно использовать только в том случае, если значительная часть поглощенной энергии выделяется не в виде тепла, а в виде света. Естественно, что это явление более редкое, поэтому в общем число люминесцентных методов меньше, чем фотометрических. В то же время люминесцентные методы при некоторых условиях более чувствительны по сравнению с фотометрическими. [c.354]
В практике количественного анализа вместо выхода флуоресценции часто используют интенсивность флуоресцентного излучения. Между этой величиной и концентрацией существует такая же зависимость, как между концентрацией и выходом флуоресценции. Определяя интенсивность флуоресценции в приборах, описанных ниже, и пользуясь калибровочным графиком, можно определять неизвестные концентрации флуоресцирующего вещества. Повышение температуры приводит к уменьшению выхода флуоресценции (рис. 90). Уменьшение выхода с повышением температуры называется температурным гашением флуоресценции. Очевидно флуоресцентный метод анализа можно проводить только при невысоких температурах. [c.152]
В атомно-флуоресцентной пламенной спектрометрии, как и в молекулярных флуоресцентных методах анализа, мощность флуоресценции прямо пропорциональна мощности излучения первичного источника при длине волны, поглощаемой атомами в пламени. Для проведения качественного анализа первичный источник должен испускать излучение в широком спектральном диапазоне, чтобы обеспечить возбуждение флуоресценции максимального числа элементов. К сожалению, хотя [c.701]
B. Атомно-флуоресцентная спектрометрия. . . 105 Г. Флуоресцентные методы анализа. …. 106 Д. Хемилюминесценция……..108 [c.73]
Г. ФЛУОРЕСЦЕНТНЫЕ МЕТОДЫ АНАЛИЗА [c.106]
Газовое пламя применяют в атомно-флуоресцентном методе анализа растворов. Этот метод еще не нашел достаточного освещения в монографиях, хотя является весьма перспективным. [c.213]
И. Ф. Туров, Новости медицины, вып. 26, 19 (1952). Объективный флуоресцентный метод анализа в практике гигиенического исследования воздуха. [c.308]
Туров И. Ф. Объективный флуоресцентный метод анализа в практике гигиенического исследования воздуха. [Определение суммарного содержания продуктов пиролиза масел, керосина и глицерина.] Новости медицины, 1952, вып. 26, с. 19—26. 8268 Тюрин И. В. К методике анализа для сравнительного изучения состава почвенного перегноя или гумуса. Тр. Почв, ин-та им. Докучаева, 1951, 38, с. 5—21. Библ. 7 назв. 8269 [c.312]
Атомно-флуоресцентный метод анализа пока еще мало применяют для аналитических целей, так как достигаемые пределы обнаружения лишь в немногих случаях превосходят таковые для атомной абсорбции [311]. В частности, для определения ртути предложен атомно-флуоресцентный метод с применением низ- [c.211]
И. Ф. Туров, Объективный флуоресцентный метод анализа в практике [c.365]
Чем объясняется низкий предел обнаружения флуоресцентного метода анализа [c.365]
В заключение следует отметить, что при внедрении в практику работы лабораторий флуоресцентных методов анализа освоение их целесообразно поручать аккуратным и педантичным в работе аналитикам, имеющим опыт работы по фотометрическим способам определения. Предварительное усвоение ими кратких основ флуориметрии и практическая проверка методик на растворах чистых солей значительно способствуют успеху и сокращают сроки освоения этого метода. В системе Государственного геологического комитета СССР большую роль в успешном внедрении флуориметрии в практику массовой производственной работы аналитических лабораторий и в ее дальнейшем развитии должны сыграть работники методических групп. [c.26]
Для определения содержания окситрихлорида ванадия в четыреххлористом титане применяли рентгено-флуоресцентный метод анализа с использованием анализатора УКА-2. Образцы для анализа готовили следующим образом. [c.26]
Эта глава посвящена в основном теории и аналитическим результатам, полученным при применении импульсных лазеров на красителях в комбинации с пламенами и электротермическими атомизаторами, обычными в атомно-флуоресцентной спектроскопии. Возбуждение флуоресценции непрерывными лазерами описано в гл. 8. Характеристики флуоресцентного метода с лазерным возбуждением обсуждаются в аспекте процессов возбуждения и дезактивации возбуждения (разд. 4.2 и 4.3), эффектов насыщения для двух- и трехуровневых систем (разд. 4.4), влияния плотности падающего излучения источника на форму градуировочного графика (разд. 4.5) и возможности локального измерения таких физических параметров, как температура, квантовый выход, а также концентрации (разд. 4.6). Общие узлы установок для атомно-флуоресцентной спектроскопии, используемых различными авторами, рассмотрены в разд. 4.7, а аналитические результаты описаны в основном в виде достигнутых пределов обнаружения по отношению к водным растворам в разд. 4.8. Читателю можно также рекомендовать две обзорные статьи [7, 8], касающиеся общих вопросов применения в аналитической спектроскопии перестраиваемых лазеров па красителях, включая флуоресцентные методы анализа. [c.192]
Флуоресцентный метод анализа дает меньшую интенсивность спектральных линий, чем с электронным возбуждением спектра, но контрастность и порог чувствительности у него выше отсутствует фон, ибо нет тормозного излучения. Картина резко меняется, если при регистрации спектра использовать амплитудную селекцию импульсов. [c.247]
Учитывая, что флуоресцентный метод анализа обладает высокой чувствительностью, необходимо соблюдать особую тщательность и предосторожность при выполнении анализа. Все применяемые реактивы и посуда должны быть проверены в фильтрованном ультрафиолетовом свете на отсутствие флуоресценции. Воздушная среда лаборатории не должна быть загрязнена соединениями урана. На рабочем столе, где производят анализ проб и готовят стандартные перлы, нельзя одновременно проводить другой работы с соединениями урана. Необходимо следить за тем, чтобы платиновая петля не была загрязнена соединениями урана. Видимые остатки плава фторида натрия удаляют механически. Для полной очистки петли от металла ее накаливают докрасна в окислительном пламени горелки и погружают на 2—3 сек в концентрированную химически чистую азотную кислоту и снова прокаливают. Петлю обрабатывают таким образом несколько раз и проверяют на отсутствие флуоресценции. Фильтрующие материалы должны быть проверены на отсутствие флуоресценции, для чего их обрабатывают в аналогичных условиях, как и анализируемую пробу они должны быть также проверены на отсутствие гасителей флуоресценции. Для этой цели определенное количество стандартного раствора наносят на фильтры и обрабатывают как и пробу. Интенсивность свечения полученного при этом перла сравнивают со стандартным перлом, содержащим такую же концентрацию урана. [c.129]
Лампы с полым катодом благодаря высокой интенсивности излучения, малой ширине линий, хорошим метрологическим характеристикам (отношению снгнал/шум) являются основным источником резонансного излучения света в атомно-абсорбционном и атомно-флуоресцентном методах анализа. [c.69]
Впервые включены флуоресцентные методы анализа (при облучении рентгеновскими лучами). Однако авторы дали лишь необходимую информацию об этих методах с целью показать их преимущества по сравнению со мйоги-ми другими, приведенными в этой книге. [c.9]
Хотя авторы не имеют достаточного опыта работы в области рент-гено-флуоресцентных методов анализа других циркониевых сплавов, яет сомнения, что эти материалы можно анализировать аналогичными методами. Например, /Са-излучение может быть использовано для определения большинства компонентов сплавов, за исключением молибдена в сплаве Zr30, в котором определению мешает /Ср-излуче- [c.167]
Советская автоматическая станция Луна-10 в 1966 г. провела первые дистанционные анализы лунной поверхности. На станции был установлен гамма-спектрометр, с помощью которого удалось получить первые сведения о содержании радиоактивных элементов в породах Луны. Эти данные привели к заключению, что морские районы Луны содержат горные породы, по своему составу близкие к земным базальтам. Дистанционный автоматический анализ лунных пород, начатый Луной-10 , был продолжен луноходами. На Луноходе-1 , а затем и на Луноходе-2 были установлены приборы для рентгенофлуоресцентного анализа лунного грунта. Приборы эти назывались несколько необычно, почти поэтично РИФМА. А происхождение этого названия очень простое— оно образовано начальными буквами названия метода рентгеновский изотопный флуоресцентный метод анализа. Поверхность Луны подвергается действию рентгеновского излучения, испускаемого изотопным источником. При этом многие атомы, входящие в состав лунных пород, ионизируются. Испускаемое этими атомами вторичное рентгеновское излучение имеет энергию, соответствующую определенному элементу. Измеряя это вторичное излучение, нетрудно определить природу ионизирующихся элементов и их концентрацию. [c.33]
В последние 20 лет бурно развивается и все чаще используется в практике нефтехимических аналитических лабораторий рентген-флуоресцентный метод анализа. РФА основан на зависимости наблюдаемой интенсивности спектра флуоресценции, соответствующего данному элементу, от его содержания в пробе [9]. РФА, благодаря своей универсальности, избирательности, экс-прессности и отсутствию многих недостатков, присущих НАА и РРМ, успешно используется в различных областях науки, техники и промышленности. Он может быть применен для анализа 1твердых образцов (порошки, металлы, силавы), так и жидкостей (масла, нефти, растворы). Метод позволяет проводить, [c.45]
Особой областью флуоресцентного анализа является изучение ферментативной активности в жидких средах, тканях и клетках. Для большинства известных в настоящее время ферментов разработаны чувствительные флуоресцентные методы анализа, основанные на собственной флуоресценции самих ферментов или продуктов их метаболизма. В то же время в последние годы разработаны очень чувствительные методы определения активности ферментов с помощью флуоресцирующих метчиков. Для этого используют флуорогенные соединения, являющиеся комплексом субстрата фермента и химически связанного с ним флуорохрома (обычно флуорохромом является аминофлуоресцеин). В растворе флуорогенные соединения не флуоресцируют, а при наличии в исследуемой среде активного специфического фермента субстрат подвергается разрушению, флуорохром высвобождается и возникает интенсивная флуоресценция. Для анализа активности клеточных эстераз был предложен диацетат флуоресцеина, который легко проникает в живые клетки и, расщепляясь с освобождением флуоресцеина, придает клеткам с активными эсте-разами зеленую флуоресценцию. Аналогичным образом можно определять и лигазную активность клетки — об использовании метчиков энзимологии см. работы Рубина [57] и Мейселя [24]. [c.297]
В заключение настоящего раздела остановимся на сравнительной оценке чувствительности атомно-абсорбционного и атомно-флуоресцентного методов анализа. Как известно, атомная флуоресценция, как одно из самостоятельных направлений спектрального анализа, была изучена и использована Вайнфорднером с сотрудниками [65—67] ). По существу, это — эмиссионный метод, основанный, в отличие от обычной пламенной фотометрии, не на термическом, а на радиационном возбуждении излучения. [c.243]
Костякова И. А. Применение флуоресцентного метода анализа к открытию хинина [c.284]
Ю 5—10 %, для Ад и С(1— 10 %). Высокая плотность атомных паров, получаемая при импульсном термическом испарении в холодную зону поглощения обеспечивает получение таклвысокой чувствительности при атомно-флуоресцентном методе анализа (до 10 —10 %) (табл. 4.2). Локализация паров в нагретой зоне поглощения увеличивает чувствительность определения на полпорядка и более в зависимости от элемента. Так, предел обнаружения Сс1 и Ад достигает 5-10 %, Мп 4-10 %, Аи — 3-10-8%. [c.204]
В течение последних лет все больщее значение приобретают физические методы определения кремния, среди которых наиболее популярны атомно-абсорбционный и атомно-эмиссионный, а также рентгено-флуоресцентный методы анализа [309]. На первый взгляд физические методы имеют значительные преимущества перед химическими, так как они экспрессны и не требуют предварительной минерализации пробы. Более подробное рассмотрение этих методов в приложении к анализу органических соединений позволяет точнее определить область, где их использование, безусловно, целесообразно. Для атомноабсорбционного и, атомно-эмиссионного методов характерны помехи от матричных эффектов и от структуры молекулы. При анализе атомно-абсорбционным методом возникают затруднения также и для веществ, образующих соединения, устойчивые в пламени. Рентгено-флуоресцентный анализ экспрессен и удобен при одновременном определении нескольких элементов. Матричные эффекты здесь также следует учитывать. К преимуществам этого метода относится его недеструктивность, т. е. возможность анализа пробы без ее разложения или растворения, а также отсутствие надобности в пробоподготовке, если в распоряжении аналитика имеется достаточное количество вещества (сотни миллиграммов). [c.166]
Предлагается прием рентгеноспектральяого флуоресцентного метода анализа тонких пленок, использующих изменение интенсивности вторичного излучения содержащихся в пленках элементов с вариацией угла отбора флуоресценции. [c.230]
Современная аналитическая химия (1977) — [
c.106
]
Источник