Антикоагулянт кровь для анализа пробирка
![Антикоагулянт кровь для анализа пробирка Антикоагулянт кровь для анализа пробирка thumbnail](https://medinn.ru/media/covers/4_PmHtLAV.png.700x0_q85.png)
Вакуумная пробирка — основной инструмент для забора венозной крови. Она может быть наполнена реагентом, который позволит провести быстрый и точный анализ. В таком случае каждая пробирка имеет колпачок своего цвета. Цветное кодирование соответствует международному стандарту ISO 6710.
Вакуумные пробирки для получения сыворотки (биохимия, серология). Цвет крышечки – коричневый или красный
Сыворотка крови – жидкая часть крови лишенная форменных элементов и некоторых белков (фибрин и др.) в отличие от плазмы, в которой сохраняются все элементы жидкой части крови кроме форменных элементов.
Получение сыворотки крови является результатом двухступенчатого биохимического процесса: свертывания (коагуляции) крови и ретракции (уплотнения) сгустка. Для запуска коагуляционного каскада необходимо наличие внешнего активатора, каковым может служить кремния диоксид, поэтому процесс свертывания крови быстрее происходит в стеклянных пробирках, так как кремния диоксид является базовым материалом стекла или в пластиковых пробирках с активатором свертывания. Активатор свертывания (clot activator) выполнен в виде напыления на внутренней стенке пробирки.
После образования сгустка начинается этап его уплотнения и выделения сыворотки. На практике ретракция сгустка ускоряется центрифугированием пробирок с кровью.
Для получения максимально чистой сыворотки рекомендуется соблюдение трех условий:
1. После забора крови в пробирку в соответствии с инструкцией необходимо осторожно однократно перевернуть пробирку для более полного контакта крови с активатором свертывания;
2. Дождаться завершения процесса свертывания крови в течение 20-30 минут при комнатной температуре и вертикальном положении пробирки;
3. Центрифугировать пробирку со свернувшейся кровью не менее 10 минут с ускорением 1500 G (примерно 3000 об/мин) для максимального выдавливания сыворотки из сгустка. При необходимости допускается центрифугирование с ускорением 4000G c крышечкой и до 12000G без крышечки.
После центрифугирования и полной ретракции сгустка сыворотка располагается над сгустком, но в контакте с ним. Сохраняется опасность загрязнения сыворотки составляющими сгустка при неосторожном обращении с пробиркой (встряхивание, опрокидывание и пр.). Для лучшего очищения сыворотки и более полного разграничения сыворотки и сгустка применяются специальные пробирки, содержащие биологически инертный олефиновый гель. Последний представляет собой тиксотропный кополимер, который тяжелее сыворотки, но легче кровяного сгустка, поэтому после центрифугирования гель в виде тонкой полоски занимает промежуточное положение и служит разделительным барьером. Стабильность такого барьера гарантирована в течение 5-7 дней при хранении пробирки с кровью при комнатной температуре.
Оптимальные сроки сохранности образца крови в данных пробирках составляет при комнатной температуре 6 часов, при хранении в холодильнике (+4ºС) – 24 часа. Повторное центрифугирование пробирок, особенно с гелем, не допускается.
Полученная сыворотка крови применяется для очень широкого спектра лабораторных биохимических, ИФА и иммунологических исследований:
белковый состав, ферменты, гормоны, онкомаркеры, ВИЧ-инфицирование, гепатиты и пр.
Вакуумные пробирки для получения цельной крови или плазмы
Не все анализы в клинике делаются из сыворотки крови. Для многих видов исследований необходима цельная кровь, содержащая форменные элементы, или плазма, освобожденная от клеток крови центрифугированием. С целью получения несвернувшейся крови разработаны пробирки с определенными добавками – антикоагулянтами. На практике используют два вида антикоагулянтов:
ингибиторы (вещества, вызывающие торможение) тромбина. Тромбин является ключевым игроком в коагуляционном каскаде. Он принимает участие в формировании ряда факторов свертывания крови и способствует трансформации фибриногена в фибрин. Добавление биохимических ингибиторов тромбина эффективно активирует антикоагуляционные свойства крови.
связывание (удаление) ионов Ca2+. При прочих равных условиях свертывание крови происходит при активном участии ионов Ca2+. Удаление их является эффективным механизмом сохранения крови в жидком состоянии.
Гепарин. Цвет крышечки – зеленый, светло-зеленый
Гепарин — кислый мукополисахарид с молекулярной массой 4000-40000 – является натуральным антикоагулянтом, присутствующем в любом здоровом организме. Гепарин активирует создание комплексных соединений между антитромбином III и такими факторами свертывания крови, как тромбин, факторы XIIa, XIa, Xa, IXa и VIIa. В таком комплексе факторы свертывания инактивируются необратимо.
Для целей получения плазмы крови в пробирки добавляют литиевую либо натриевую соль гепарина в пропорции к забираемой в пробирку кровью 15-20 МЕ/1 мл, что служит гарантией полной инактивации свертывания крови и не искажает исследуемые параметры. Эритроциты сохраняются в образце крови до 8 часов. Нельзя использовать для проведения анализов образец крови, хранившийся более 48 часов даже в условиях холодильника (+4ºС).
Для получения качественного результата анализа необходимо:
Немедленно после взятия крови осторожно перевернуть пробирку 5-7 раз для лучшего перемешивания крови и гепарина,
Плазма отделяется после центрифугирования. Нормальные скорости центрифугирования – 1000-1500G (2000-3000 об/мин). При необходимости допускается центрифугирование с ускорением 4000G c крышечкой и до 12000G без крышечки.
В клинике пробирки с гепарином применяются, в основном для проведения исследования:
электролитного состава крови,
газового состава крови,
содержания алкоголя в крови.
Не рекомендуется использовать гепарин для: морфологических исследований, так как кислотный характер гепарина способствует обесцвечиванию мазка крови, придавая ему голубоватый оттенок, подсчета лейкоцитов и тромбоцитов, поскольку гепарин стимулирует агрегацию этих клеток крови.
исследований по методике полимеразной цепной реакции (ПЦР).
Для более чистого разграничения плазмы крови и сгустка применяются специальные пробирки, содержащие кроме гепарина инертный олефиновый гель. Последний представляет собой тиксотропный кополимер, который тяжелее плазмы, но легче форменных клеток крови, поэтому после центрифугирования гель в виде тонкой полоски занимает промежуточное положение и служит разделительным барьером.
Фторид натрия/ЭДТА калия. Цвет крышечки – серый
Добавление фторида натрия и ЭДТА калия в пробирку позволяет предотвратить разрушение глюкозы крови (процесс, называемый гликолизом) и сохранить ее уровень во взятом образце крови.
Фторид натрия и оксалат калия выступают в качестве антикоагулянтов, связывая ионы Са2+ и, кроме того, фторид натрия стабилизирует уровень глюкозы.
Глюкоза разрушается до пирувата и лактата при последовательном осуществлении различных энзиматических реакций. Фторид натрия ингибирует некоторые ферментативные реакции, включая превращение фосфоглицерата в фосфоенолпируватацид, и предотвращает гликолиз.
Для получения качественного результата анализа необходимо:
немедленно после взятия крови осторожно перевернуть пробирку 5-7 раз для лучшего перемешивания крови и антикоагулянта
плазма отделяется после центрифугирования. Нормальные скорости центрифугирования – 1000-1500G (2000-3000 об/мин).
Пробирки с добавлением фторида натрия и оксалата калия используют для проведения определения уровня сахара (глюкозы) в крови. Соотношение компонентов 1/1, общее количество добавляемых реагентов – 4,5 мг/1 мл забираемой в пробирку крови.
Замечания: Фторид блокирует активность уреазы и некоторых других ферментов. Образцы крови из данных пробирок нельзя использовать для прямого определения энзимов. Фторид натрия и ЭДТА калия связывают ион Са2+, заменяя в крови 1 ион кальция на 2 иона натрия или калия. Следствием этого является повышение напряжения ионов в межклеточной жидкости и выкачивание воды из внутриклеточного пространства в межклеточное, сморщивание клеток крови с умеренным «выдавливанием» из эритроцитов гемоглобина. Поэтому видимый гемолиз свойственен образцам крови с данной добавкой.
Глюкоза превращается в лактат в результате комплекса реакций, включающего в себя различные этапы. Фторид ингибирует один их последних этапов разрушения глюкозы, начальные этапы с участием гексокиназы и фосфофруктокиназы блокируются менее эффективно, поэтому можно наблюдать снижение содержания глюкозы в образце крови на 6-7% от первоначального.
После первоначального незначительного снижения уровня глюкозы ее количество остается постоянным при хранении крови в пробирке в течение 8-10 часов при температуре до 25ºС и в течение 2-3 дней в холодильнике (+4ºС).
ЭДТА-К2. Цвет крышечки — сиреневый
Этилендиаминтетраацетат (ЭДТА) является предпочтительным антикоагулянтом для гематологических исследований. ЭДТА и его щелочные соли способны создавать хелатные соединения с ионами кальция с образованием растворимых высокостабильных комплексов. Наиболее эффективная концентрация ЭДТА – 1,2 мг/мл крови. Во всем мире используют три варианта солей ЭДТА: ЭДТА-К3, ЭДТА-К2 и ЭДТА-Na2. Наиболее предпочтительной и рекомендуемой Международной Комиссией по Стандартизации в Гематологии является двукалиевая соль ЭДТА:
ЭДТА-К3 показывает меньшую способность поддержания крови в жидком состоянии, также ЭДТА-К3 влияет на подсчет лейкоцитов, занижая их количество.
различия между ЭДТА-К2 и ЭДТА-Na2 в клиническом плане незначительны и ими можно пренебречь, но ЭДТА-Na2 хуже растворим.
Для получения качественного результата анализа необходимо:
немедленно после взятия крови осторожно перевернуть пробирку 5-7 раз для лучшего перемешивания крови и антикоагулянта;
плазма отделяется после центрифугирования. Нормальные скорости центрифугирования – 1000-1500G (2000-3000 об/мин). При необходимости допускается центрифугирование с ускорением 4000G c крышечкой и до 12000G без крышечки.
Наиболее широко используются пробирки, содержащие 1,95 мг ЭДТА/1мл крови. Они нашли свое применение в таких областях лабораторной практики, как:
гематологические исследования – подсчет клеток крови, определение СОЭ и пр.
ПЦР-исследования (качественные и количественные методики).
Пробирки с образцами крови можно хранить до 6-10 часов при 4ºС, хранение свыше 24 часов не рекомендуется из-за снижения числа эритроцитов и лейкоцитов.
Цитрат натрия. Цвет крышечки — голубой
Цитрат натрия является антикоагулянтом для сбора венозной крови с це6лью проведения исследований коагуляционных свойств крови.
Процесс свертывания крови представляет собой последовательность сложных реакций, в которых результатом первых реакций (с участием активных ферментов) является активация следующих, первоначально неактивных энзимов. Последним активным ферментом в этой цепочке присутствует тромбин, который осуществляет превращение фибриногена в фибрин. Нити фибрина опутывают клетки крови и окончательно формируют кровяной сгусток. Крайне важную роль на этом этапе играют ионы Са2+. Антикоагуляционные свойства цитрата проявляются в формировании комплекса с ионами Са2+ и эффективном удалении их из крови.
Общее исследование свертывания крови определяется временем, необходимым для последовательной активации ферментов, участвующих в коагуляционном процессе. Проводится определение времени активации и количественное измерение различных составляющих коагуляционного каскада, для чего создаются так называемые «обходные пути» добавлением некоторых промежуточных продуктов свертывания.
Наиболее часто используются пробирки с 3,8% или 3,2% раствором цитрата натрия (0,129 моль/л), соотношение цитрата к количеству забираемой крови 1/9.
Для максимально качественного проведения коагулологических исследований рекомендуется соблюдение определенных правил:
нельзя использовать пробирку для взятия крови на коагуляционные тесты первой, сразу после венепункции, так как на результаты может повлиять выделяющийся при пункции тканевой тромбопластин;
венозный жгут во время взятия крови в пробирку должен быть снят;
немедленно после взятия крови пробирку аккуратно переворачивают 5-6 раз для лучшего перемешивания крови и антикоагулянта;
сразу после этого надо проверить количество взятой крови: ее верхняя граница должна быть на уровне голубой полоски на этикетке.
Оптимальными условиями хранения пробирки с образцом крови является температура 20-24ºС и исследование коагуляционных свойств и факторов свертывания крови должно быть проведено в течение 2-х часов с момента взятия крови
Источник
Основным видом биологического материала, который подвергается анализу, является кровь. Кровь состоит из клеток (эритроциты, лейкоциты и тромбоциты) и жидкой части, которая представляет собой раствор многих неорганических и органических веществ. Эта и есть та жидкость, которую анализируют в большинстве лабораторных тестов. Поэтому первым этапом после взятия проб крови и перед отправкой их в лабораторию, является отделение жидкой части крови от клеток путем центрифугирования проб. Жидкая часть крови, которую получают после центрифугирования, может быть плазмой или сывороткой.
ПРОБЫ КРОВИ
1. Цельная кровь
Цельная кровь — проба венозной, артериальной или капиллярной крови в которой концентрация и свойства клеточных и внутриклеточных компонентов остаются относительно неизмененными по сравнению с состоянием in vivo. Добавление антикоагулянтов в пробу цельной крови стабилизирует клеточные и внутриклеточные компоненты на определенный период времени.
2. Сыворотка
Сыворотка — неразделенная внеклеточная часть крови после завершения адекватного процесса свертывания крови. Для отделения сыворотки от клеток крови в пробе крови, взятой у пациента, вакуумную пробирку следует оставить при комнатной температуре в течение, по меньшей мере 30 мин. Для получения качественной пробы важно выдержать полное время свертывания крови. Этот период может быть короче в случае использования активатора свертывания.
Преимущества использования сыворотки по сравнению с плазмой обусловлено тем, что добавление антикоагулянтов может вызывать интерференцию с некоторыми аналитическими методами лабораторного анализа или изменять концентрацию определяемых компонентов:
примесь катионов в антикоагулянтах: NH4+, Li+, Na+, K+;
интерференция аналитов, вызванная связываем металлов с ЭДТА и цитратом (например, снижение активности щелочной фосфатазы при связывании цинка, снижение активности металлопротеиназ, угнетение металлозависимой активации клеток при функциональных тестах, связывание ионизированного кальция гепарином);
интерференция фибриногена в гетерогенных иммунных исследованиях;
ингибирование метаболических или каталитических реакций гепарином (например, Taq полимеразы в полимеразной цепной реакции);
интерференция ЭДТА, цитрата с распределением ионов между внутри- и межклеточными пространствами (например, Cl-, NH4+);
электрофорез белков следует проводить только в сыворотке.
Интерференция — вмешательство постороннего фактора в результаты анализа.
3. Плазма
Если в вакуумную пробирку (вакутейнер) с пробой крови добавлен антикоагулянты, кровь остается жидкой (не сворачивается) и получаемая после центрифугирования жидкая часть, называется плазмой.
Преимущества использования плазмы:
экономия времени: пробы крови могут быть отцентрифугированы сразу после их получения (нет необходимости ждать не менее 30 минут для получения сыворотки);
выход плазмы из одного и того же объема крови на 15-20% больше, чем сыворотки;
предотвращение, вызванной свертываем интерференции при использовании сыворотки.
Вследствие вызванных свертыванием крови в вакумной пробирке изменений некоторые исследования дают достоверные результаты, только при использовании плазмы (например, нейроспецифическая енолаза, серотонин, аммиак).
АНТИКОАГУЛЯНТЫ
Антикоагулянты — это добавки, которые тормозят процесс свертывания крови и/или плазмы, что обеспечивает отсутствие существенных изменений исследуемых компонентов перед аналитическим процессом.
- ЭДТА
- Цитрат
- Гепарин
- Гирудин
Свертывание крови предотвращается путем связывания ионов кальция (ЭДТА, цитрат натрия) или торможением активности тромбина (гепарин, гирудин). Твердые или жидкие антикоагулянты, находящиеся в вакуумных пробирках должны быть смешены с кровью немедленно после взятия проб крови.
1. ЭДТА
ЭДТА — соль этилендиаминтетрауксусной кислоты. Используют двукалиевую (К2), трикалиевую (К3) и двунатриевую (Na2) соли. Концентрации: от 1,2 до 2,0 мг/мл крови (от 4,1 до 6,8 ммоль/л крови) из расчета безводной ЭДТА. Для гематологических исследований предпочтительно использовать вакуумные пробирки с К2 ЭДТА, так как он обеспечивает большую стабильность размера клеток крови и не разбавляет образец.
2. Цитрат
В вакуумных пробирках для исследования системы гемостаза используется жидкий трехзамещенный цитрат натрия (дигидротринатрия цитрат Na3C6H5O7*2H2O) в концентрации:
0,105 моль/л; 3,13% (31,3 г/л);
0,109 моль/л; 3,20% (32,0 г/л);
0,129 моль/л; 3,80% (38,0 г/л).
Согласно рекомендациям ВОЗ и Национального комитета по стандартизации в клинической лаборатории (США) предпочтительнее использовать 0,109 моль/л (3,20%) тринатрийцитрат лимонной кислоты. Для исследования показателей системы гемостаза рекомендуется смесь одной части цитрата с 9 частями крови.
Для определения скорости оседания эритроцитов (СОЭ) используют 0,105 моль/л (3,13%) тринатрийцитрат лимонной кислоты. При исследовании СОЭ смешивают одну часть цитрата с 4 частями крови.
В целях обеспечения стабильности образцов крови для исследования показателей гемостаза в вакуумных пробирках используются комплексные наполнители (цитрат натрия/теофиллин,/аденозин/дипиридамол) Пробирки с этим наполнителем используют для обычных рутинных тестов, мониторинга терапии гепарином, анализе антигепаринового фактора тромбоцитов 4, β-тромбомодулина. Пробирки с комплексным наполнителем нельзя использовать для исследования агрегации тромбоцитов. Соотношение антикоагулят/кровь в этих пробирках 1:9 при концентрации цитрат натри 0,109 моль/л (3,20%). Вакуумные пробирки с комплексным наполнителем рекомендуются при централизации исследований системы гемостаза.
3. Гепарин
Для получения стандартизованной гепаринизированной плазмы рекомендуется от 12 до 30 международных единиц (МЕ)/мл нефракционированной натриевой, литиевой или аммиачной соли гепарина с молекулярной массой от 3 до 30 кД.
Титрованный по кальцию гепарин при концентрации от 40 до 60 МЕ/мл (сухая гепаринизация) и от 8 до 12 МЕ/мл крови (жидкая гепаринизация) рекомендуется для определения ионизированного кальция.
4. Гирудин
Гирудин представляет собой антитромбин, экстрагированный из пиявок или полученный с помощью генно-инженерного синтеза. Гирудин тормозит тромбин, образуя комплекс гирудин- тромбин в соотношении 1:1. Используется в концентрации 10 мг/л.
ЦВЕТОВАЯ КОДИРОВКА ВАКУУМНЫХ ПРОБИРОК С АНТИКОАГУЛЯНТАМИ
В стандарте ИСО 6710 представлены следующие цветовые коды антикоагулянтов:
ЭДТА — сиреневый/красный;
цитрат для исследования системы гемостаза — бледно голубой/зеленый;
цитрат для СОЭ — черный/розовато лиловый;
гепарин — зеленый/оранжевый;
без добавок (для получения сыворотки) — красный/белый.
Цветовая кодировка крышек вакуумных пробирок соответствует цветовым кодам, используемых в них антикоагулянтов.
Источник