Анализ на блокирующий фактор сыворотки крови

Изобретение относится к области медицины, в частности к способам определения состояния иммунной системы женщины, и может найти применение в диагностике патологии беременности.

Известно, что в течение беременности функциональная активность иммунной системы женщины снижена. Это отражает наличие феномена неспецифической иммуносупрессии, необходимой для успешного внутриутробного развития полуаллогенного плода.

Течение беременности во многом определяется реакцией иммунной системы матери на отцовские антигены плода. Слабую выраженность этой реакции связывают с вероятностью самопроизвольного прерывания беременности на ранних сроках. В качестве недостаточности реакции иммунной системы матери рассматривается отсутствие блокирующей способности ее сыворотки, развитие которой является необходимым атрибутом физиологической беременности.

Блокирующая способность определяется наличием так называемых блокирующих факторов — растворимых факторов женской сыворотки, включающих не только антитела к антигенам плода, появляющиеся во время беременности, но и стероидинициируемые белки беременности, гидролитические ферменты, иммунные комплексы, антиидиотипические антитела, растворимые формы рецепторов к цитокинам и другим иммунорегуляторным молекулам.

Известен способ определения блокирующих свойств женской сыворотки по ингибированию пролиферативного ответа женских лимфоцитов на стимуляцию митогенами, в частности фитогемагглютинином (ФГА), в культуре при добавлении сыворотки в среду инкубации (К.В.Шмагель, В.А.Черешнев «Иммунитет беременной женщины». — М.: Медкнига, 2003, стр.225). Оценка пролиферативной активности лимфоцитов в культуре регистрируется по синтезу ДНК с использованием радиоактивно меченого Н3-тимидина.

Недостатками способа является использование трудоемкого меченого Н3 и необходимость специального оборудования и помещения для обеспечения безопасности работающего персонала.

Задача настоящего изобретения — упрощение способа определения блокирующих свойств женской сыворотки за счет исключения трудоемких реагентов и использования специального оборудования и помещения.

Поставленная задача решается способом определения блокирующего эффекта аутологичной женской сыворотки, включающим инкубирование женских лимфоцитов в культуре с добавлением фитогемагглютинина и аутологичной женской сыворотки, и где дополнительно инкубируют лимфоциты в среде с добавлением фитогемагглютинина и в среде с добавлением фитогемагглютинина и пулированной АВ-сыворотки, по окончании инкубации к каждой из проб добавляют меченые FITC антитела к CD69, оценивают интенсивность флуоресценции каждой из проб и определяют блокирующий эффект по формуле

где A1 — доля клеток, несущих маркер CD69, в культуре женских клеток, стимулированных ФГА,

А2 — доля клеток, несущих маркер CD69, в культуре женских клеток, стимулированных ФГА с добавлением АВ-сыворотки,

А3 — доля клеток, несущих маркер CD69, в культуре женских клеток, стимулированных ФГА с добавлением аутологичной женской сыворотки,

Ак — доля клеток, неспецифически связывающих иммуноглобулины того типа, к которому принадлежат антитела к CD69.

Кровь для анализа брали натощак из локтевой вены в стерильные пробирки. Лимфоциты выделяли стандартным методом центрифугирования в градиенте плотности с использованием смеси фиколлверографин плотностью 1,077. Сыворотку крови получали стандартным способом. Для проведения анализа сыворотку инактивировали нагреванием на водяной бане при 56°С в течение 30 минут.

Лимфоциты инкубировали в 96-луночных планшетах при 37°С в атмосфере с 5% CO2. Каждая лунка содержала по 0,25×106 лимфоцитов в среде RPMI-1640 с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки. В каждую лунку добавляли 50 мкл раствора ФГА с концентрацией 100 мкг/мл. Характер реакции женских лимфоцитов исследовали при добавлении 50 мкл женской сыворотки или 50 мкл пулированной АВ-сыворотки и без указанных добавок. Суммарный объем инкубационной смеси в каждой лунке составил 250 мкл.

Интенсивность пролиферации оценивали методом проточной цитофлуориметрии с использованием прямых, меченых FITC антител к CD69. Для этого после инкубации в течение 72 часов клетки снимали из лунок планшета в стандартные 1,5 мл пробирки типа Eppendorf, ресуспендировали в растворе PBS с 0,5 mM EDTA, отмывали в PBS и метили антителами к CD69 (Becton-Dickinson, США) и пропидием иодидом. Интенсивность флуоресценции оценивали на живых клетках на цитофлуориметре FACScan (Becton-Dickinson, США).

Блокирующий эффект аутологичной сыворотки рассчитывали как разницу блокирующих эффектов в средах с АВ-сывороткой и исследуемой сывороткой.

Блокирующие эффекты сывороток рассчитывали как отношение доли клеток, несущих маркер CD69, в среде без добавления сывороток, к доле клеток, несущих маркер CD69, в средах с добавлением АВ-сыворотки и аутологичной сыворотки и выражали в процентах.

Пример.

Определение блокирующего эффекта женской сыворотки проводили у практически здоровой фертильной женщины 30 лет (пациентки X), имеющей двух детей в возрасте 6 лет и 4 года. Обе беременности протекали без осложнений; искусственных, самопроизвольных абортов и неразвивающихся беременностей, а также урогенитальных инфекций в анамнезе нет.

Кровь для анализа у пациентки Х брали натощак из локтевой вены в стерильные пробирки. Лимфоциты выделяли стандартным методом центрифугирования в градиенте плотности с использованием смеси фиколлверографин плотностью 1,077. Сыворотку крови получали стандартным способом. Для проведения анализа сыворотку инактивировали нагреванием на водяной бане при 56°С в течение 30 минут.

Лимфоциты инкубировали в 96-луночных планшетах при 37°С в атмосфере с 5% СО2. Каждая лунка содержала по 0,25×106 лимфоцитов в среде RPMI-1640 с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки. В каждую лунку добавляли 50 мкл раствора ФГА с концентрацией 100 мкг/мл. Характер реакции женских лимфоцитов исследовали при добавлении 50 мкл женской сыворотки или 50 мкл пулированной АВ-сыворотки и без указанных добавок. Суммарный объем инкубационной смеси в каждой лунке составил 250 мкл.

Интенсивность пролиферации оценивали методом проточной цитофлуориметрии с использованием прямых меченых FITC антител к CD69. Для этого после инкубации в течение 72 часов клетки снимали из лунок планшета в стандартные 1,5 мл пробирки типа Eppendorf, ресуспендировали в растворе PBS с 0,5 mM EDTA, отмывали в PBS и метили антителами к CD69 (Becton-Dickinson, США) и пропидием иодидом. Интенсивность флуоресценции оценивали на живых клетках на цитофлуориметре FACScan (Becton-Dickinson, США).

Блокирующий эффект аутологичной сыворотки рассчитывали по вышеуказанной формуле.

Результаты обследования пациентки X:

A1=84,7%, А2=77,1%, А3=59,3%, Ак=3,0%; (табл.).

Блокирующий эффект = -(59,3-77,1)/(84,7-3,0)×100%=21,8%.

Проведение измерений блокирующей способности женской сыворотки у женщин вне беременности, беременных на разных сроках гестации с использованием предлагаемого способа, показали результаты, согласующиеся с литературными данными (фиг.1-4). Самая низкая блокирующая активность — сыворотки фертильных женщин (имеющих в анамнезе двое нормальных физиологических родов) вне беременности (фиг.1). По мере увеличения срока гестации увеличиваются и блокирующие свойства сыворотки, достигая максимальных значений перед родами (фиг.2-4). При этом с увеличением срока гестации наблюдается снижение экспрессии CD69 на стимулированных ФГА лимфоцитах и без добавления в культуральную среду женской сыворотки (фиг.4). Оба эти факта отражают наличие феномена неспецифической иммуносупрессии, сопровождающей развитие нормальной беременности.

Поэтому способ оценки функционального состояния иммунной системы женщины, связанный с определением блокирующих свойств аутологичной женской сыворотки по характеру экспрессии маркера ранней пролиферации CD69 в стимулированных митогенами культурах женских лимфоцитов, может быть использован в клинико-лабораторной диагностике патологии беременности.

Результаты клинических исследований блокирующих свойств сыворотки женщин вне и в ходе беременности с использованием описанного способа представлены в таблице. Согласно полученным данным наблюдаемое увеличение блокирующего эффекта сыворотки в ходе беременности во втором и третьем триместрах носит статистически достоверный характер.

Полученный результат отражает наличие феномена неспецифической иммуносупрессии, сопровождающей развитие нормальной беременности. Поэтому способ оценки функционального состояния иммунной системы женщины, связанный с определением блокирующих свойств аутологичной женской сыворотки по характеру экспрессии маркера ранней пролиферации CD69 в стимулированных митогенами культурах женских лимфоцитов, может быть использован в клинико-лабораторной диагностике патологии беременности.

Фиг.1

Гистограммы распределения интенсивности флуоресценции лимфоцитов женщины вне беременности, меченных ФИТЦ-антителами к антигену ранней пролиферации CD69. А — контроль. Б — в отсутствие сыворотки. В — эффект АВ-сыворотки. Г — эффект аутологичной сыворотки. Пунктиром указано положение маркера.

Фиг.2

Гистограммы распределения интенсивности флуоресценции лимфоцитов женщины в состоянии беременности 1-го триместра, меченных ФИТЦ-антителами к антигену ранней пролиферации CD69. А — контроль. Б — в отсутствие сыворотки. В — эффект АВ-сыворотки. Г — эффект аутологичной сыворотки. Пунктиром указано положение маркера.

Фиг.3

Гистограммы распределения интенсивности флуоресценции лимфоцитов женщины в состоянии беременности 2-го триместра, меченных ФИТЦ-антителами к антигену ранней пролиферации CD69. А — контроль. Б — в отсутствие сыворотки. В — эффект АВ-сыворотки. Г — эффект аутологичной сыворотки. Пунктиром указано положение маркера.

Фиг.4

Гистограммы распределения интенсивности флуоресценции лимфоцитов женщины в состоянии беременности 3-го триместра, меченных ФИТЦ-антителами к антигену ранней пролиферации CD69. А — контроль. Б — в отсутствие сыворотки. В — эффект АВ-сыворотки. Г — эффект аутологичной сыворотки. Пунктиром указано положение маркера.

Способ определения блокирующего эффекта аутологичной женской сыворотки, включающий инкубирование женских лимфоцитов в среде с добавлением фитогемагглютинина и аутологичной женской сыворотки, в среде с добавлением фитогемагглютинина и пулированной АВ-сыворотки, в среде с добавлением фитогемагглютинина и в среде без добавок, далее по окончании инкубации к каждой из проб добавляют меченые FITC антитела к CD69, оценивают интенсивность флуоресценции каждой из проб и определяют блокирующий эффект по формуле:

где А1 — доля клеток, несущих маркер CD69, в культуре женских клеток, стимулированных ФГА;
А2 — доля клеток, несущих маркер CD69, в культуре женских клеток, стимулированных ФГА с добавлением АВ-сыворотки;
А3 — доля клеток, несущих маркер CD69, в культуре женских клеток, стимулированных ФГА с добавлением аутологичной женской сыворотки;
АК — доля клеток, неспецифически связывающих иммуноглобулины того типа, к которому принадлежат антитела к CD69.