Анализ крови на стерильность среды

                Департамент  здравоохранения  Воронежской  области

           БУЗ  ВО  «Воронежская  областная  клиническая  больница  №1»

Исследование крови на стерильность

на современном этапе

Информационно-методическое  письмо  для  врачей-бактериологов

   Составители: главный внештатный специалист  по микробиологической диагностике

департамента здравоохранения Воронежской области, заведующий бактериологической лабораторией

БУЗ ВО ВОКБ №1   Е.В. Бондаренко

Врач-бактериолог БУЗ ВО ВОКБ№1 Т.М. Лапа

Воронеж

2015

Кровь — один из наиболее распространенных образцов биоматериала, исследуемых в бактериологической лаборатории. Исследование крови на стерильность является важнейшим методом лабораторного исследования у пациентов с определенными показаниями.

Основные показания для посева крови:

• Лихорадка (более 38°C)
• Гипотермия (менее 36°C)
• Лейкоцитоз
• Гранулоцитопения

Бактерии проникают в кровь экзогенным (например, при травме) и эндогенным (из очага инфекции) путями.

Бактериемия: Наличие бактерий в крови, подтвержденное результатами посева

• Транзиторная бактериемия, когда происходит кратковременный выброс в кровь микроорганизмов под действием таких факторов, как физическая нагрузка, перегревание, переохлаждение. Подобные явления протекают обычно бессимптомно.
• Интермиттирующая бактериемия, когда существует локальный очаг инфекции, например пневмония или внутрибрюшной абсцесс.
• Продолжающаяся бактериемия проявляется внутрисосудистой

инфекцией, например, инфекционным эндокардитом или септическим тромбофлебитом.

Сепсис – это патологический процесс, в основе которого лежит реакция организма в виде генерализованного (системного) воспаления на инфекцию различной природы (бактериальную, вирусную, грибковую).

В последнее десятилетие в мире отмечается учащение случаев бактериемии и фунгемии. Это связано с развитием инвазивных медицинских вмешательств, старением населения, увеличением количества трансплантаций органов и костного мозга, увеличением количества более вирулентных и трудно поддающихся лечению микроорганизмов, более агрессивной внутрибольничной инфекцией.

Факторы риска, способствующие проникновению бактерий в кровяное русло и развитию бактериемии:

• внутривенные катетеры
• катетер мочевого пузыря
• любые инвазивные процедуры
• операционные вмешательства
• нейтропения
• терапия антибиотиками (эмпирическая), кортикостероидами, цитотоксическая                      

Гемокультивирование является в настоящее время «золотым стандартом» в диагностике септицемии

Принципы микробиологической диагностики

Точный диагноз устанавливается только при обнаружении возбудителей в крови пациентов. Важное условие — своевременный забор пробы. Для проведения анализа используют кровь непосредственно из венозного сосуда. Сбор пробы из постоянного внутривенного или внутриартериального катетеров допускается только в случаях подозрения на наличие катетер-ассоциированной инфекции или отсутствия возможности ее получения венопункцией.

• Лихорадка и озноб начинается примерно через час после попадания микроорганизмов в кровоток
• Чаще всего кровь забирается как можно скорее после приступа лихорадки или озноба при подозрении на инфекцию
• Забор крови должен осуществляться по возможности до назначения антимикробной терапии.

Объем крови – один из наиболее значимых факторов в повышении чувствительности гемокультивирования. Считается, что риск случайной контаминации 1 отдельно взятой пробы крови составляет 3% (0,03).

Тогда вероятность случайной контаминации одновременно 2 проб составляет: 0,03*0,03=0,0009= 0,09%. Поэтому более информативно исследование 2 и более проб каждая объемом не менее 10мл.

Рекомендуемое число отбираемых проб крови в зависимости от предполагаемого заболевания по МУ 4.2.2039-05Техника сбора и транспортирования биоматериалов в микробиологические лаборатории:

 1) Острый сепсис, менингит, менингококоцемия, остеомиелит, артрит, острая пневмония,  пиелонефрит 2 пробы из двух сосудов или двух участков кровеносного сосуда перед началом антибактериальной терапии

2) Лихорадка неясного генеза 4 сначала 2 пробы из разных кровеносных сосудов (двух участков сосуда), затем через 24-36 ч. еще 2 пробы

3) При подозрениях на наличие эндокардита и вялотекущего сепсиса: при обострении 2 пробы из двух сосудов в течение первых 1 — 2 ч подъема температуры тела (не на пике температуры!)  до начала терапии;  при подостром и вялотекущем течении сначала 3 пробы с интервалом 15 мин. и более. Если все пробы отрицательны, на вторые сутки после посева собирают еще 3

4) у пациентов с эндокардитами, получающими антибиотики, собирают по 2 отдельные пробы в течение трех дней

5) У больных, в комплекс терапии которых включены антибиотики, собирают 6 проб в течение 48 ч; пробы необходимо собирать непосредственно перед введением следующей дозы препарата

6) при лихорадке неясного генеза сначала 2 пробы из разных кровеносных сосудов, затем через 24-36 часов еще 2 пробы

Минимальный набор сред для посева крови согласно положениям Приказа 535:

“Двойная среда” — скошенный во флаконе 1,7-2% питательный агар (150 мл) и 150 мл полужидкой среды, приготовленной на питательном бульоне с добавлением 15 г глюкозы и 0,15 г агара.

“Среда для контроля стерильности” — стандартная тиогликолевая среда к которой  добавляют 15-20 г дрожжевого экстракта и агар 4,25-5 г на 1 литр к среде добавляют  0,001 г резазурина в качестве индикатора анаэробиоза.

 Необходимое оснащение для взятия крови:

• Флаконы с питательными средами.
• 70о  этиловый спирт;
• 2% или 5% настойка йода
• венозный жгут
• резиновые (латексные, виниловые) перчатки
• спиртовка (только при использовании флаконов со средами, изготовленными в лаборатории)

 Техника получения пробы крови. Сбор проб крови для посева производят 2 человека у постели больного или в процедурной.

— участок кожи над выбранным для пункции сосудом продезинфицировать: обработать кожу тампоном, смоченным 70%-м этиловым спиртом, затем другим тампоном, смоченным 1 — 2%-м раствором йода или другим дезинфектантом, разрешенным к применению для этих целей в установленном порядке, круговыми движениями, начиная от центра, в течение 30 с; подождать, пока высохнет обработанный участок. Не допускается пальпировать сосуд после обработки кожи перед введением иглы;

— при работе с флаконами с двойной средой: стерильным шприцем собрать у взрослых 10 мл крови, у детей — 5 мл; над пламенем спиртовки открыть флакон; внести кровь во флакон из шприца, предварительно сняв иглу; обжечь горлышко и пробку флакона в пламени спиртовки, закрыть флакон пробкой; осторожно, чтобы не замочить пробку флакона, перемешать его содержимое круговыми движениями.

Отобранный материал быстро доставляется в лабораторию.  Образцы крови замораживать нельзя! Микроскопию мазков крови проводят при подозрении на паразитарные инфекции (малярия, трипаносомоз), при бактериальных инфекциях это нецелесообразно, так как единственная бактерия, обнаруживаемая в мазках,-  Borreliarecurrentis. Посевы инкубируют при 37°С с ежедневным просмотром в течении 8 дней. При отсутствии видимого роста со всех сред кроме «двойной среды» среды для контроля стерильности делают высевы на кровяной агар и мазки на 3,5,8 дни. При отсутствия роста дают отрицательный ответ на 9-10 день. При наличии помутнения, образования хлопьев, крошек, необходимо произвести высев из флакона независимо от дня исследования.

Визуальные признаки роста гемокультур при посевах крови

Причины отрицательных результатов:

— Локальная инфекция (защитные силы организма удерживают инфекцию в одном месте)

— Неактуальное время взятия материала (вероятность упустить интермиттирующую бактериемию )

     — Слишком маленький объем полученного материала

— Прием антибиотиков пациентом

 Идентификация выделенных бактерий при бактериемиях:

• Значимы и часто встречаются — S.aureus, S.pneumoniae, E.coli и др. энтеробактерии, P.aeruginosa, C.albicans
• Значимы —  S.pyogenes, S.agalactiae, L.monocytogenes, N.meningitidis, N.gonorrhoeae, H.influenzae, B.fragilis группа, Candida spp, Cryptococcus neoformans
• Контаминанты или нет? (зависит от конкретных случаев)– КОС, зеленящие стрептококки, Propionibacterium acnes, Acinetobacter  calcoaceticus, Clostridium spp., Corynebacterium spp., Bacillus spp

Дополнительные критерии в пользу клинической значимости изолята:

— Быстрое выделение культуры – в течение первых 48 часов

— Выделение монокультуры

— Выделение одного и того же вида микроорганизма в разных пробах

— Выделение одного и того же вида микроорганизма из крови и других локусов

Помимо ручных методов существуют методы автоматизированного культивирования крови, которые являются более современными, более чувствительными. Самая известная  серия бактериологических анализаторов для посева крови на стерильность,- BDBACTEC.

Прибор Bactec предназначен для ускоренного обнаружения бактерий и грибов в клинических образцах крови. Образцы крови отбираются у пациентов и вносятся напрямую в оригинальные флаконы с питательной средой, после чего – по возможности незамедлительно – помещаются в рабочие станции приборов серии BD Bactec™ 9000. Наличие микроорганизмов в крови устанавливается с помощью высокочувствительной флуоресцентной технологии, основанной на индикации СО2, выделяемого в питательную среду растущими и интенсивно делящимися микроорганизмами. С помощью системы BD BACTEC 90% положительных результатов выявляются в первые 24 часа инкубации, что позволяет своевременно начать эмпирическую антибактериальную терапию либо внести изменения в действующую схему лекарственной терапии. Своевременная бактериологическая диагностика бактериемии значительно сокращает частоту возникновения септического шока и увеличивает выживаемость больных.

Флаконы для гемокультивирования выпускаются нескольких видов. Наиболее часто используются следующие:

• Флаконы со средой для культивирования аэробов
• Флаконы со средой для культивирования анаэробов

— содержат частицы латекса, адсорбирующие антибиотики из крови, а также способствующие лизису клеток крови и освобеждению внутриклеточных бактерий.

• Флаконы со средой для культивирования детской крови

— предназначены для исследования малого объема крови до 3 мл, также содержат частицы латекса

• Флаконы с селективной средой для выявления дрожжей и грибов

— содержат хлорамфеникол и тобрамицин для подавления роста сопутствующих бактерий, лизирующие вещества, способствующие освобождать из лейкоцитов фагоцитированные грибы.

Используется вакуумное взятие крови с использованием системы для забора крови  игла-бабочка. Под действием вакуума кровь втягивается через иглу  BD VacutainerTM  напрямую из вены в пробирки BD VacutainerTM и флаконы BD BactecTM и сразу же смешивается с питательной средой.

Традиционно отбор проб крови осуществляется одномоментно в аэробный (BD BACTEC™ PLUS+ Aerobic/F) и в анаэробный (BD BACTEC™ PLUS+ Anaerobic/F) флаконы. Альтернативный набор складывается из: а) аэробного флакона и дополнительного аэробного; б) анаэробного и/или Mycosis IC/F, и/или Myco F/Lytic флаконов (оба типа флаконов – для культивирования гемокультур грибов).

Оптимальный объем крови для гемокультивирования

• Дети:
• Новорожденные         1-2 мл крови/флакон (допустимый для посева объём крови – 0,5-5 мл)
• Дети                                           2-5 мл/флакон
• Подростки                               10-20 мл/флакон            
• Взрослые:

         Одномоментно 20 -30 мл (по 10 мл во флакон) крови 2 или 3 раза в течение 24 ч

При правильном заборе крови контаминация составляет не более 2-3 % всех гемокультур. Использование наборов для забора крови BD VacutainerTM существенно снижает степень контаминированности культур.

При наличии роста микроорганизма во флаконе анализатор оповещает персонал лаборатории с помощью световой индикации на передней панели прибора, а также с помощью звуковой индикации. Таким образом, нет необходимости делать высевы из всех флаконов, высев делается целенаправленно из положительного флакона.

Объем исследований и микропейзаж при гемокультивировании в бактериологических лабораториях ЛПУ Воронежской области.

 Общее количество проб крови для исследования на стерильность по Воронежской области составило 12515. В 2013г это число было гораздо меньше: 8406. Доля этих анализов по лечебно-профилактическим учреждениям показана в таблице:

Общее количество положительных высевов из образцов крови по области 1245, что составило 9,95% , в 2013г 808, что составило 9,6%.

Микропейзаж выделенных культур:

Наиболее часто из крови выделялись следующие культуры: S. аureus- 165, коагулазоотрицательные стафилококки- 639  (основная масса- S. epidermidis- 478), Enterococcus faecalis- 74, Pseudomonas sp- 59, Klebsiella- 54, E. coli-31, Enterococcus faecium 36. Среди грибов рода Candida чаще всего выделялись C. albicans и C. glabrata.

В небольшом количестве выделялись:  Enterobacter-18, Ps. aeruginosa 20, Acinetobacter 17, Streptococcus spp 20.

В количестве от 2 до 5 выделялись такие культуры, как Str.viridans, Str.   β-haemolyticus, Str pyogenes, Proteus mirabilis, Proteus vulgaris, Candida tropicalis, Candida  krusei.

Все бактериологические лаборатории в Воронежской области, за исключением двух, исследуют кровь на стерильность ручными методами. Бактериологические анализаторы «Бактек» имеются в бактериологических лабораториях Воронежской областной клинической больницы №1 и в лаборатории Перинатального центра 1к. В результате анализа микробиологического мониторинга за 2011-2014гг в этих лабораториях отмечается  увеличение количества высеваемости культур микроорганизмов. До использования аппаратной технологии высеваемость микроорганизмов из крови в составляла в 2010-2012гг от 6 до 10%, при исследовании с помощью «BD Bactec 9050» в 2013г- 24,7%, в 2014г-26,9% у взрослых пациентов и у новорожденных в 2013гг 17,5%, в 2014г-20,3%.

Литература

1. «Руководство по медицинской микробиологии» под редакцией А.С. Лабинской, Н.Н. Костюковой, Москва, 2013г

2. «Методы клинических лабораторных исследований». Справочное пособие под редакцией В.В. Меньшикова. Том 3 Клиническая микробиология. М, 2009.

3. «Лаборатория» журнал для врачей №5 2014г

4. «Клиническая микробиология» П.Р. Мари, И.Р. Шей,  краткое руководство, пер с англ., Москва, 2006г

5. Клиническая Микробиология и Антимикробная Химиотерапия
2013, том 15 (4).