Анализ крови на сифилис нетрепонемные тесты
Анализ на сифилис является одним из самых распространенных среди лабораторных исследований. Широко используются анализы на сифилис при проведении профилактических обследований. При помощи микроскопии выявляется возбудитель сифилиса — бледная трепонема. При помощи серологических реакций подтверждается диагноз сифилиса, устанавливается диагноз скрытого сифилиса, проводится контроль эффективности лечения, определяется излеченность больных.
Диагноз сифилиса устанавливается на основании клинических данных, обнаружении возбудителей сифилиса в образцах материала и подтверждении диагноза серологическими методами исследования. Проявления сифилиса многочисленны и многообразны, ввиду чего болезнь выявляется врачами разных специальностей. Дифференциальная диагностика первичного сифилиса проводится с целым рядом заболеваний.
Рис. 1. На фото первичное проявление сифилиса — твердый шанкр.
Антитела к бледной трепонеме и серологическая диагностика
При заражении сифилисом в организме больного образуются антитела. Серологическая диагностика помогает врачу изучать динамику образования антител в организме больного сифилисом в начальных стадиях заболевания, в период лечения и после его окончания, решить вопрос рецидив заболевания у больного или повторное заражение (реинфекция), поставить диагноз сифилиса при массовых медицинских условиях.
Антитела к бледной трепонеме IgM
Первыми после заражения начинают вырабатываться антитела IgM. Они начинают выявляться при помощи серологических реакций уже со второй недели после заражения. На 6 — 9 неделях заболевания их количество становится максимальным. Если больной не лечился, то антитела исчезают через полгода. Антитела IgM исчезают через 1 — 2 мес. после лечения раннего сифилиса, через 3 — 6 мес. — после лечения позднего сифилиса. Если регистрируется их рост, то это служит признаком рецидива сифилиса или говорит о повторном заражении. Молекулы IgM крупные и через плаценту к плоду не переходят.
Антитела к бледной трепонеме IgG
Антитела иммуноглобулины IgG появляются в конце первого месяца (на 4-й неделе) от момента заражения. Их титр выше, чем титр IgM. IgG сохраняются после излечения достаточно длительное время.
Неспецифические антитела
Существует множество серологических реакций. Это объясняется антигенной множественностью бледных трепонем. В сыворотке крови больного человека на разных стадиях сифилиса кроме специфических образуются те или иные неспецифические антитела — агглютинины, комплементсвязывающие, иммобилизины, антитела, вызывающие иммунную флюоресценцию, преципитины и др. Серологические реакции по выявлению неспецифических антител обладают относительной специфичностью поэтому, чтобы избежать диагностических ошибок, следует пользоваться не одним, а комплексом серологических реакций (КСР).
Ложноположительные анализы на сифилис
Отличительной особенностью нетрепонемных тестов является получение ложноположительных реакций. Антитела-реагины, которые вырабатываются в крови человека против кардиолипинового антигена, регистрируются не только при сифилисе, но и при других заболеваниях: коллагенозах, гепатитах, заболеваниях почек, тиреотоксикозе, онкозаболеваниях, при инфекционных заболеваниях (лепра, туберкулез, бруцеллез, малярия, сыпной тиф, скарлатина), при беременности и месячных циклах, при приеме жирной пищи и алкоголя. Отмечено, что с возрастом количество ложноположительных реакций возрастает.
Рис. 2. На фото первичный сифилис у женщин.
к содержанию ↑
Лабораторная диагностика сифилиса с применением серологических реакций
Серологические тесты на сифилис подразделяются на трепонемные и нетрепонемные.
1. Нетрепонемные тесты
В качестве антигена в этой группе тестов используется кардиолипиновый антиген. Липидные антигены возбудителей сифилиса самые многочисленные. Они составляют 1/3 сухой массы клетки. С помощью нетрепонемных тестов выявляются антитела-реагины, которые вырабатываются против кардиолипинового антигена. В эту группу входит реакция связывания комплемента (РСКкард), реакция микропреципитации (РМП), реакция быстрого определения реагинов плазмы (RPR) и др. С помощью нетрепонемных тестов проводится первичный скрининг на сифилис (обследование групп населения), а возможность получения результатов в количественном варианте позволяет использовать эти тесты с целью контроля эффективности лечения. Положительные результаты нетрепонемных тестов должны подтверждаться трепонемными тестами. Отличительной особенностью нетрепонемных тестов является получение ложноположительных реакций.
2. Трепонемные тесты
В трепонемных тестах используются антигены трепонемного происхождения, выделенные из культуры бледных трепонем. С их помощью подтверждаются положительные результаты нетрепонемных тестов. В группу входят: РСКтреп — реакция связывания комплемента, РИФ — реакция иммунофлюоресценции и ее модификации, РИТ, РИБТ — реакция иммобилизации бледных трепонем, РПГА — реакция пассивной гемагглютинации, ИФА — иммуноферментный анализ.
3. Тесты на сифилис с использованием рекомбинантных антигенов
Антигены для данной группы тестов получают генно-инженерным путем и используют в реакциях — РПГА и ИФА, в анализах иммуноблоттинга (ИБ) и иммунохроматографическом анализе.
Рис. 3. Для диагностики сифилиса используется комплекс серологических тестов.
к содержанию ↑
Диагностика сифилиса с применением нетрепонемных тестов
Для выявления сифилиса используются нетрепонемные тесты или комплекс серологических реакций (КСР). Серологическая диагностика применятся с 5-й недели от момента заражения или с 2-3 недели после появления твердого шанкра. Антитела выявляются практически у всех больных со свежим первичным, вторичным и рецидивным сифилисом. Серологические реакции положительные у 70 — 80% больных с третичным активным сифилисом, в 50 — 60% случаев у больных третичным скрытым сифилисом.
Серологические реакции с применением нетрепонемных тестов могут давать ложноположительные результаты.
Рис. 4. Забор крови для проведения анализа на сифилис.
к содержанию ↑
Реакция связывания комплемента (РСК кард, КСК с КА, реакция Вассермана)
Реакция Вассермана (RW, РВ), изобретенная А. Вассерманом более 100 лет назад, сегодня претерпела множество изменений, однако, как дань традиции, сохранила свое название по настоящее время. Реакция связывания комплемента с применением кардиолипинового антигена предназначена не только для выявления антител, но и выполняется в количественном варианте — с разными разведениями сыворотки, что позволяет использовать ее для контроля эффективности лечения. Низкая чувствительность и специфичность, получение ложноположительных результатов — отрицательные стороны данного вида исследования.
Суть реакции Вассермана заключается в следующем: антигены, которые применяются при постановке реакции Вассермана, в случае наличия антител к возбудителям сифилиса в крови человека посредством комплимента связываются с ними и выпадают в осадок. Интенсивность реакции обозначают знаком (+). Реакция может быть отрицательной (-) — отсутствие осадка, сомнительной (небольшой осадок или +), слабоположительной (++), положительной (+++) и резко положительной (++++).
Более чувствительной является видоизмененная реакция Вассермана — реакция Колмера. С ее помощью выявляются антитела в сыворотках, где реакция Вассермана дала отрицательный результат.
При резко положительных реакциях проводится количественное определение реагинов, для чего используется сыворотка в разведениях от 1:10 до 1: 320, что позволяет использовать данный вид исследования для контроля эффективности лечения. Например, снижение титра антител и последующая их серонегативация (получение отрицательных результатов), говорит об успешном излечении заболевания.
Рис. 5. Анализ крови на сифилис — реакция Вассермана.
Микрореакция преципитации (МРП)
Микрореакция преципитации применяется для массовых обследований отдельных групп населения, диагностики сифилиса и контроля над эффективностью лечения. Для проведения данного вида исследования необходимо небольшого количества исследуемого материала. В основе микрореакции преципитации лежит иммунологическая реакция антиген-антитело. В случае наличия антител в сыворотке крови обследуемого комплекс антиген-антитело выпадает в осадок с образованием хлопьев. Реакция проводится в лунках специальной стеклянной пластины. Оценивается по интенсивности выпавшего осадка и величине хлопьев в (+) как реакция Вассермана. При обследовании беременных, доноров и для контроля эффективности лечения не применяется. VDRL и RPR являются разновидностями микрореакций.
Рис. 6. Вид реакции преципитации в капле на стекле.
Рис. 7. Анализ крови на сифилис — реакция микропреципитации.
Рис. 8. Набор для проведения реакции быстрого определения реагинов плазмы (Тест на сифилис RPR).
Все положительные тесты, полученные при проведении неспецифических серологических реакций, требуют подтверждения специфическими реакциями — трепонемными тестами.
к содержанию ↑
Диагностика сифилиса с применением трепонемных тестов
При проведении трепонемных тестов используются антигены трепонемного происхождения. Их отрицательной стороной является невозможность использования для контроля эффективности проводимого лечения, получение положительных результатов при спирохетозах и невенерических трепонематозах и получение ложноположительных результатов при онкологических заболеваниях, лепре, некоторой эндокринной патологии. Такие тесты, как РПГА, ИФА и РИФ остаются положительными многие годы после излечения сифилиса, а в некоторых случаях и пожизненно.
РИБТ и РИФ являются более специфическими из всех серологических реакций, применяемых для диагностики сифилиса. Они позволяют различать ложноположительные реакции, выявлять поздние формы сифилиса, протекающие с отрицательными реакциями. При помощи РИБТ распознаются ложноположительные реакции у беременных, когда необходимо решить вопрос об инфицированности ребенка.
Реакция иммобилизации бледных трепонем (РИБТ, РИТ)
Суть реакции заключается в том, что антитела, находящиеся в сыворотке крови больного, обездвиживают бледные трепонемы. Отрицательной считается реакция при иммобилизации до 20% возбудителей, слабоположительная — 21 — 50%, положительная — 50 — 100%. РИБТ иногда дает ложноположительные результаты. Тест сложный и трудоемкий, однако, является незаменимым при проведении дифференциальной диагностики скрытых форм заболевания и ложноположительных результатов серологических реакций, в том числе у беременных. РИБТ дает 100% положительный результат при вторичном, раннем и позднем сифилисе, в 94 — 100% случаев — при других формах сифилиса.
Реакция иммунофлюоресценции (РИФ)
Суть реакции заключается в том, что бледные трепонемы (антигены), соединенные с антителами, меченными флюорохромами, издают в люминесцентном микроскопе желто-зеленое свечение. Результат оценивается знаком (+). С помощью РИФ выявляются иммуноглобулины класса А. Реакция иммунофлюоресценции становится положительной раньше, чем реакция Вассермана. Она всегда положительная при вторичном и латентном сифилисе, в 95 — 100% случаев положительная при третичном и врожденном сифилисе. Техника проведения данного вида исследования проще, чем у РИБТ, но заменить РИФ на РИБТ невозможно, так данная реакция уступает РИБТ по специфичности. РИФ-10 (модификация РИФ) более чувствительна, РИФ-200 и РИФ-абс более специфичны.
Рис. 9. Анализ крови на сифилис — реакция иммунофлюоресценции (РИФ).
Реакция иммунного прилипания бледных трепонем (РИПБТ)
Суть реакции заключается в том, что сенсибилизированные сывороткой больного бледные трепонемы в присутствии комплемента прилипают к поверхности эритроцитов. Полученные комплексы при цетрофугировании выпадают в осадок. Чувствительность данного теста и специфичность близки к РИФ и РИБТ.
Иммуноферментный анализ на сифилис (ИФА)
С помощью ИФА определяются иммуноглобулины класса М и G. Методика IgM – ИФА может быть использована в качестве скринингового и подтверждающего теста. Чувствительность ИФА и его специфичность аналогичны РИФ. При сифилисе ИФА дает положительные результаты с третьего месяца инфицирования и довольно долго (иногда всю жизнь) остается положительным.
Рис. 10. Иммуноферментный анализатор.
Реакция пассивной (непрямой) гемагглютинации (РПГА)
РПГА основана на способности эритроцитов, на которых адсорбированы антигены бледной трепонемы, в присутствии сыворотки больного склеиваться (гемагглютинация). РПГА применяется для диагностики всех форм сифилиса, в том числе скрытого. При применении высокого качества антигена данный вид серологической реакции превышает все остальные тесты по специфичности и чувствительности.
Рис. 11. РПГА применяется для диагностики всех форм сифилиса.
Рис. 12. Анализ на сифилис — реакция пассивной (непрямой) гемагглютинации (схема).
Рис. 13. Вид перевернутого зонтика, занимающего все дно пробирки, свидетельствует о положительной реакции. В случае, когда эритроциты оседают столбиком («пуговка») в центре дна пробирки говорят об отрицательной реакции.
Рис. 14. Тест РПГА в лабораторных условиях.
к содержанию ↑
Микробиологическая диагностика
Наряду с серологической диагностикой методика обнаружения бледных трепонем (микробиологическая диагностика) играет важную роль, особенно в период серонегативного сифилиса, когда еще в крови отсутствуют антитела, но уже есть первые проявления свежего первичного сифилиса (твердый шанкр).
Биологическим материалом для исследования служит отделяемое с поверхности твердых язв (шанкров), содержимое пустулезных сифилидов, мокнущих и эрозивных папул, пунктаты инфицированных лимфатических узлов, ликвор и амниотическая жидкость, для проведения ПЦР — кровь.
Наилучшей методикой обнаружения возбудителей сифилиса является исследование биологического материала в темном поле микроскопа. Данная методика позволяет увидеть бледные трепонемы в живом состоянии изучить ее особенности строения и движения, отличить патогенные возбудители от сапрофитов.
Рис. 15. Анализ на сифилис — темнопольная микроскопия.
Рис. 16. При изучении сухих мазков используется окраска по Романовскому-Гимзе. Бледные трепонемы окрашиваются при этом в розовый цвет, все остальные виды спирохет — в фиолетовый.
Обнаружение бледных трепонем при микроскопии в темном поле — абсолютный критерий окончательной диагностики сифилиса.
Рис. 17. Для выявления бактерий применяется реакция иммунофлюоресценции (РИФ) — трепонемный тест. Специфический комплекс антиген- антитело при соединении со специфической сывороткой, меченной флюорохромом, в свете люминесцентного микроскопа дает свечение бактерий зеленоватым цветом.
Рис. 18. Возбудители сифилиса хорошо просматриваются в мазках, приготовленных по методике Левадити (импрегнация серебром). Бледные трепонемы темного цвета на фоне желтой окраски клеток инфицированных тканей.
Рис. 19. Возбудитель сифилиса при многократном увеличении.
Рис. 20. На фото колонии бледных трепонем. Получить культуру бактерий тяжело. Они практически не растут на искусственных питательных средах. На средах, содержащих лошадиную и кроличью сыворотки, колонии появляются на 3 — 9 сутки.
к содержанию ↑
ПЦР на сифилис
Эффективным и перспективным сегодня является методика проведения полимеразной цепной реакции. ПЦР на сифилис позволяет получить результат в течение нескольких часов, а в собранном для диагностики материале может присутствовать хотя бы несколько возбудителей заболевания.
Рис. 21. ПЦР на сифилис позволяет обнаружить ДНК или ее фрагменты бледных трепонем.
Чувствительность данного метода исследования зависит от наличия в биологическом материале бледных трепонем и достигает 98,6%. Специфичность данного теста во многом зависит от правильного выбора мишени для амплификации при проведении диагностики и достигает 100%.
Вместе с тем, в связи с недостаточно изученной сравнительной характеристики чувствительности и специфичности прямых методов диагностики сифилиса и ПЦР, данный метод обследования в РФ для диагностики заболевания пока не разрешен.
ПЦР на сифилис разрешено проводить лишь в некоторых случаях, как дополнительный метод диагностики врожденного сифилиса, нейросифилиса, при затруднениях проведения диагностики сифилиса с использованием серологических методов исследования у ВИЧ-больных.
Рис. 22. Выявление ДНК бледной трепонемы с применением ПЦР говорит либо о наличии жизнеспособных бактерий, либо об остатках погибших, но содержащих способных к образованию дополнительных копий отдельных участков хромосомной ДНК.
Статьи раздела «Сифилис»
Самое популярное
ПОНРАВИЛАСЬ СТАТЬЯ?
Подпишитесь на нашу рассылку!
Источник
Среди методов серологической диагностики сифилиса, очень широко используются нетрепонемные тесты.
У этой категории анализов высокая чувствительность, благодаря чему они позволяют выявлять инфекцию уже через 2-4 недели от момента заражения.
Но специфичность недостаточна, поэтому положительные результаты приходится подтверждать другими исследованиями.
В ответ на попадание бледной трепонемы в организм человека, наша иммунная система начинает синтезировать иммуноглобулины или антитела.
Первыми в крови появляются IgM.
Они обладают низкой авидностью к поверхностным белкам патогенной спирохеты и также связываются с другими биологическими антигенами.
Экспериментальным путем было установлено, что активнее всего они реагируют на кардиолипин.
Это белок из сердца крупного скота с добавкой лецитина и холестерола.
Нетрепонемные тесты: разновидности
Дерматовенерология для лабораторного контроля спирохетной инвазии практикует два разных типа нетрепонемных реакций.
Один тип тестов, с оценкой результата под микроскопом, более активно используется за рубежом.
Реакций всего две:
- Venereal Disease Research Laboratory, (VDRL).
- Проба с непрогретыми сывороточными реагинами.
Несмотря на необходимость дополнительного микроскопического контроля результатов, такие анализы из практики не вышли.
Причина – высокая чувствительность: положительный ответ можно получить уже через неделю от развития твердого шанкра.
Для трактовки результатов анализов другого типа достаточно невооруженного взгляда.
И потому они очень широко распространены:
- I. Наиболее «древняя», РСК — реакция связывания комплемента. <
- II. Микрореакция преципитации – более новая, точная и рекомендованная Минздравом, МРП.
- III. Новейшие тесты, в латинской аббревиатуре – RPR : быстрые (rapid) плазменные (plasma) реагины (reagins).
- IV. Тест TRUST с непрогретой сывороткой и толуидиновым красным.
Постановка этих проб проводится в лунке специального планшета и если реакция состоялась, то это можно заметить невооруженным взглядом.
Диагностическая роль нетрепонемных тестов
На первый взгляд, проводить анализы, которые позволяют выявлять нетрепонемные антигены, в диагностике сифилиса бессмысленно.
Однако:
- Они дешевые.
- Реагенты производятся промышленным путем, стандартизировано.
- Для проведения теста не нужно особого оборудования.
- Чтоб получить результат, требуется меньше 24 часов.
- Позволяют дать качественную и полуколичественную оценку сифилитической инфекции.
Наибольшую ценность представляют для выявления и контроля серонегативных форм сифилиса.
То есть позволяют обнаружить болезнь тогда, когда из-за иммунных особенностей специфические антитела к антигенам бледной трепонемы в крови не выявляются.
Такая ситуация – не редкость при нейросифилисе, первичном скрытом и позднем сифилисе.
Нетрепонемные тесты: качественная оценка
Для того, чтоб выявить, заразен ли человек, берется цельная кровь из вены.
Некоторые тесты требуют, чтоб в работу шла плазма и тогда порцию крови предварительно необходимо отцентрифугировать.
Затем исследуемый образец в лунке специального планшета смешивают с эмульсией неспецифического (кардиолипинового) антигена.
Иммуноглобулины, которые содержатся в крови больного сифилисом человека, с этими белками прореагируют.
Так, для положительной реакции микропреципитации с нетрепонемным, кардиолипиновым антигеном, нужно, чтоб в тестируемом образце появились хлопья слипшегося белка.
Увидеть такой результат можно простым взглядом.
Подобная проба была очень актуальна в свое время, так как стала одним из первых научных способов выявления людей, зараженных патогенной спирохетой.
В современной медицине нарастает популярность реагиновых тестов ( RPR ).
Их отличия от реакции микропреципитации весьма заметны:
- Высокая чувствительность – до 98%.
- На проведение нужно до 8 минут.
- Методика подходит и для индивидуального и массового обследования (скрининга).
- Ингредиенты и результаты строго стандартизованы.
Кроме заключения о том, что человек заражен бледной трепонемой, могут быстро дать оценку и активности болезни.
Полуколичественная оценка в нетрепонемных тестах
Суть такого диагностического подхода проста: раз в крови больного человека есть противосифилитические антитела, то их концентрацию можно измерить.
Для этого проводится титрование.
Берут образец плазмы и ставят одну из проб.
Если результат положительный, то исследуемый материал разбавляют в 2 раза физраствором (титруют) и снова тестируют.
Титрование повторяют до негативного ответа.
Количество разведений и есть титр: в начале болезни он высок, а по мере выздоровления будет снижаться.
У выздоровевшего человека – анализы становятся негативными без разведения.
Таким образом нетрепонемные тесты, как и трепонемные, позволяют контролировать динамику болезни.
Только дешево и быстро.
Недостатки нетрепонемных тестов
Но если бы нетрепонемные реакции были бы идеальными, то не понадобились бы другие методики.
На самом деле, для них характерны не 100% чувствительность и специфичность.
У некоторых категорий людей вероятность ложноположительного результата особенно высока:
- Пожилые.
- Страдающие сахарным диабетом.
- Ревматические больные.
- Заболевания крови.
- Онкология.
- Острые бактериальные и вирусные инфекции.
Также бывают ложноотрицательные результаты в случае чрезмерной концентрации антител.
Выходит, что человек болен, а неразведенная сыворотка остается негативной.
Учитывая такие особенности, венерологи всегда комбинируют разные виды анализов у пациентов с высоким риском инфицирования сифилиса.
То есть даже при отрицательных МРП и PRP, могут назначаться дополнительные обследования.
Зато после установки точного диагноза, в мониторинге выздоравливающих, неспецифические пробы наиболее оптимальны.
Любому переболевшему лучше делать быстрый и дешевый нетрепонемный анализ.
И по мере убывания титра убеждаться в эффективности назначенного врачом лечения.
Если вам необходима развернутая диагностика на сифилис, обращайтесь к автору этой статьи – венерологу в Москве с 15 летним опытом работы.
Источник
