Анализ крови экспресс метод с кардиолипиновым антигеном

Реакция микропреципитации с кардиолипиновым антигеном (RPR — Rapid Plasma Reagin)

— скрининговый метод диагностики сифилиса, (является нетрепонемным тестом, так называемые реагиновые или кардиолипиновые тесты, которые проводят при первичном обследовании на сифилис) посредством определения реагинов — антител класса IgM и IgG (их еще называют реагины), образующихся против антигенов липидного происхождения, образовавшихся при повреждении клеток больного сифилисом или против липидных антигенов бледной трепонемы. Основные показания к применению: первичное обследование на сифилис, медицинские осмотры, контроль эффективности лечения.

RPR

— первичный скрининговый тест на сифилис, выявляющий антифосфолипидные антитела (своего рода отборочный тест для последующего подробного обследования на сифилис). В настоящее время одна из классических реакций диагностики сифилиса — реакция Вассермана в лабораториях практически не выполняется. На смену этой реакции пришли новые современные методы ИФА-диагностики. Метод RPR, в какой то мере, можно рассматривать как замену реакции Вассермана. Метод RPR относится к нетрепонемным тестам. Антитела выявляемые в RPR реакции появляются, как правило, появляются в крови больного через 3-5 недель после заражения (через 10 дней после появления первичного шанкра). В первые 10 дней после появления твердого шанкра они, как правило, не обнаруживаются.

Считается, что RPR-тест положителен в 78% случаев при первичном сифилисе и в 97% случаев при вторичном сифилисе. Низкий титр реагиновых антител (менее 1:8) в первую очередь свидетельствует о ложноположительной реакции, однако такие цифры можут быть и при позднем сифилисе.

Следует учитывать, что липопротеиды трепонем и тканей человека сходны друг с другом, поэтому результаты нетрепонемных реакций могут быть в ряде случаев ложноположительными. Образовавшиеся антитела могут быть неспецифическими — их называют реагины. Они образуются на липидные антигены бледной трепонемы и против аутоантигенов, которые образуются при разрушении клеток больных. Поскольку тест не специфический, то можно ожидать получение как ложноположительных, так и ложноотрицательных результатов. В случае положительной реакции RPR проводят тесты — ИФА, РПГА, РИФ, РИТ.
Присутствие в крови антител к фосфолипидам является одной из причин получения ложноположительных результатов в реакции преципитации с кардиолипиновым антигеном (VDRL-тест – Venereal Disease Research Laboratory).
В VDRL-тесте определяют агглютинацию липидных частиц, содержащих холестерин и кардиолипин. Антитела к фосфолипидам присоединяются к кардиолипину этих частиц и вызывают их агглютинацию. Аналогичная реакция наблюдается у больных сифилисом, у которых ложноположительный характер VDRL-теста должен быть доказан отрицательными результатами специфических методов исследования на сифилис, которые выявляют непосредственно антитела к трепонемным антигенам.

Ложноположительная реакция может наблюдаться при аутоиммунных заболеваниях (системная красная волчанка, склеродермия). Ложноположительная реакция также является одним из признаков АФС (в результате повышения содержания антител к кардиолипину). Выявляются, также, больные с транзиторно-положительной реакцией, которые часто болеют вирусными и бактериальными инфекциями (мононуклеоз, лепра, малярия, боррелиоз — болезнь Лайма, корь, ветряная оспа, хламидиоз, туберкулез), при беременности.

Данные антитела у больных сифилисом образуются, как правило, в 70-80% случаев при первичном сифилисе, и практически, достигают 97% у больных со вторичным и ранним латентным сифилисом. После успешного лечения сифилиса у 90% пациентов реакция RPR становится отрицательной.

Согласно приказу МЗ РФ от 26.03.2001 г. за №87 «О совершенстовании серологической диагностики сифилиса» последовательность обследования пациентов на сифилис представляется следующим образом:

• При первичном обследовании производится постановка отборочной (скрининговой) реакции микропреципитации (РМП) или её модификации (RPR — РПР, TRUST — ТРАСТ, VDRL — ВДРЛ) в количественном и качественном вариантах и в случае положительного результата — любого специфического подтверждающего трепонемного теста (РПГА, ИФА, КСР, РИФ, РИТ).
• После окончания терапии ставится РМП или её модификация и по снижению титра судят о динамике инфекционного процесса и эффективности терапии. Подтверждением эффективности проведенной терапии считается снижение титра в 4 и более раз в течение 1 года.
• По окончанию этого срока осуществляется постановка той же специфической реакции, что и при первичном обследовании. Следует учитывать, что специфические трепонемные тесты могут оставаться положительными (не негативировать) в течение ряда лет, а в отдельных случаях остаются положительными на всю жизнь.

МИКРОРЕАКЦИЯ ПРЕЦИПИТАЦИИ С КАРДИОЛИПИНОВЫМ АНТИГЕНОМ (ЭКСПРЕСС — МЕТОД)

Оборудование для взятия крови и постановки МР:

— капиллярные пипетки аппарата Панченкова;

— градуированные пипетки 1, 2, 5 и 10 мл;

— автоматические пипетки на 20-200 мкл;

— наконечники для автоматических пипеток;

— пробирки длиной 8-10 см и 14-15см, диаметром 1-1,5 см или центрифужные;

— пластинки из прозрачного материала с лунками диаметром 1-1,2 см, глубиной не менее 0,5 см;

— иглы для взятия крови из пальца и вены; шприцы;

— центрифуга, дающая не менее 1000 об/мин;

— аппарат для встряхивания;

— стерилизатор для кипячения игл, шприцов, инструментов.

Контрольные лиофилизированные сыворотки крови необходимы для установления пригодности эмульсии антигена. Отрицательную и положительную контрольные сыворотки крови используют неразведенными, слабоположительную получают из положительной путем ее разведения по титру, установленному в день приготовления эмульсии антигена. При отсутствии лиофилизированных сывороток крови используют нативную положительную или смесь положительных в РСК с кардиолипиновым антигеном или микрореакции инактивированных сывороток крови, которые разливают по 0,5 мл в пробирки с плотно закрывающимися пробками, хранят в морозильном отделении холодильника, используют с титром выше 1:8. В день постановки реакции сыворотку крови титруют на пластинке с целью подтверждения ранее установленного титра, для контроля качества эмульсии и получения слабоположительного результата, который используют затем в течение рабочего дня.

Титрование контрольной сыворотки проводят следующим образом: в 9 лунок пластинки, начиная со второй лунки, вносят по 90 мкл изотонического раствора натрия хлорида и добавляют в первую и вторую лунки по 90 мкл контрольной сыворотки крови. Содержимое второй лунки перемешивают пипеткой, насасывая и выпуская его в лунку 5-6 раз. Затем набирают 90 мкл содержимого второй лунки в пипетку и 90 мкл переносят в третью лунку. Содержимое третьей лунки перемешивают таким же образом и переносят в четвертую лунку и так далее до последней лунки. Из последней лунки 90 мкл удаляют. Во все лунки добавляют по 30 мкл эмульсии кардиолипинового антигена. Пластинку встряхивают в аппарате в течение 5 минут, добавляют по 90 мкл изотонического раствора натрия хлорида и оставляют при комнатной температуре на 5 минут, после чего регистрируют результаты. Разведение сыворотки крови, давшее слабоположительный результат (+/ 2+), используют в качестве слабоположительного контроля. Для получения его делают соответствующее разведение. Например, если слабоположительный результат получен с разведением сыворотки крови 1:8, то для получения контрольной слабоположительной сыворотки крови в пробирку вносят 0,7 мл изотонического раствора натрия хлорида и 0,1 мл положительной сыворотки крови, перемешивают.

При правильно проведенном титровании положительной сыворотки крови по мере ее разведения наблюдается равномерное уменьшение величины хлопьев преципитата.

При снижении реактивности хранящейся нативной контрольной сыворотки крови используют разведение, дающее слабоположительный результат при повторном титровании. Контрольную сыворотку крови можно использовать до тех пор, пока она дает положительный результат (4+) в разведении не ниже 1:2, и слабоположительный результат (2+) в разведении не меньше 1:4. При дальнейшем снижении реактивности употреблявшуюся положительную контрольную сыворотку крови заменяют новой.

При хранении контрольных сывороток крови не допускаются повторные замораживания их и оттаивание, т.к. в этом случае реактивность их снижается.

О снижении реактивности контрольной сыворотки крови, а не эмульсии антигена, судят по параллельному титрованию этой сыворотки крови с использованием хранившейся и вновь приготовленной эмульсии. Если получают один и тот же титр антител в МР с обеими антигенными эмульсиями, то считают, что снижение реактивности зависит от хранения контрольной сыворотки крови, если же снижение реактивности наблюдают только при использовании хранившейся эмульсии антигена, то это обусловлено снижением реактивности эмульсии антигена, которую необходимо заменить свежеприготовленной.

Серологические лаборатории кожно — венерологических диспансеров должны снабжать контрольными сыворотками крови лаборатории района, использующие в своей работе экспресс — метод и не имеющие положительных и отрицательных сывороток крови. При отсутствии контрольных сывороток крови реакцию ставить нельзя.

Эмульсия кардиолипинового антигена готовится из специального кардиолипинового антигена для микрореакции преципитации. Нельзя использовать в микрореакции кардиолипиновый антиген, предназначенный для реакции связывания комплемента.

Перед приготовлением эмульсии обращают внимание на прозрачность ампулированного антигена. При выпадении кристаллов холестерина их растворяют нагреванием ампул в термостате или водяной бане при 37 град. С или 56 град. С соответственно.

Прежде чем приготовить эмульсию, рассчитывают необходимое количество ее на рабочий день или рабочую неделю (на 50 исследований требуется 1 мл кардиолипинового антигена). В пробирку вносят сухой пипеткой не более 2 мл антигена, добавляя его к равному объему 0,9% изотонического раствора натрия хлорида, перемешивают, оставляют при комнатной температуре на 30 минут, затем центрифугируют при 1000 об/мин до получения прозрачной жидкости, которую удаляют, а к осадку добавляют 3,5 объема (по отношению к взятому антигену) 10% раствора холин — хлорида. Например, если требуемый объем антигена равен 0,5 мл, то для вычисления количества холин — хлорида 0,5 мл умножают на 3,5 и получают 1,75 мл, т.е. необходимый объем холин — хлорида. Пробирку плотно закрывают пробкой и содержимое перемешивают, опрокидывая пробирку, до полного ресуспендирования. Полученная эмульсия готова к употреблению. При необходимости приготовления большого количества эмульсии, ее готовят не в одном флаконе большой емкости, а в нескольких пробирках, внося в каждую из них по 2 мл антигена. Такие объемы обеспечивают лучшее перемешивание антигена, предохраняют его от загрязнений при повторном взятии для постановки реакции, а также от нагревания и действия солнечных лучей.

Эмульсию антигена хранят в холодильнике при 4 град. не более недели, а при добавлении раствора мертиолата — в течение 2 недель. В день постановки реакции нужное для данного рабочего дня количество эмульсии берут из холодильника, оставляют для согревания при комнатной температуре на 30 минут и перемешивают ее, опрокидывая пробирку, закрытую пробкой, не менее 30 раз, затем проверяют ее пригодность на контрольных сыворотках крови. Применяемую эмульсию необходимо защищать от света, обернув пробирки с ней черной бумагой. Пригодность каждой новой серии антигена проверяют в экспресс — методе одновременно с уже бывшей в работе серией на заведомо положительных и отрицательных сыворотках крови. О пригодности антигена судят по величине титров, наблюдаемых при одновременном титровании положительных сывороток крови с новой и проверенной сериями антигенов. Получение близких результатов, т.е. величин титров реагентов, отличающихся на +/-1 разведение, одинаковой выраженности хлопьев преципитата, наблюдаемых в одних и тех же разведениях положительных сывороток крови свидетельствует о пригодности исследуемой серии антигена. Серию антигена бракуют, если одновременное титрование контрольной положительной сыворотки крови с новой серией антигена показывает: а)слабо выраженный преципитат (2+/1+) при минимальных разведениях сыворотки крови; б) более низкий (на 2-3 разведения) титр реагинов, чем с употреблявшейся проверенной серией; в) наличие преципитата в отрицательных сыворотках крови.

Получение плазмы крови:

Кровь берут из пальца так же, как для исследования скорости оседания эритроцитов (СОЭ). При взятии крови смачивают капилляр аппарата Панченкова 5% раствором цитрата натрия, набрав раствор до метки «25», а оставшийся цитрат натрия выливают в центрифужную пробирку, куда затем вносят три капилляра крови, взятой до метки «К», перемешивают. Кровь отстаивают при комнатной температуре, а в экстренных случаях центрифугируют с целью получения плазмы крови, которую отсасывают автоматической пипеткой для проведения исследования.

Получение инактивированной сыворотки крови: Кровь берут из вены, получают сыворотку крови и инактивируют ее так же, как для РСК.

Методика постановки микрореакции:

Качественную и количественную постановки микрореакции с испытуемой плазмой и инактивированной сывороткой крови следует осуществлять следующим образом.

При использовании качественной методики постановки микрореакции автоматической пипеткой забирают по 90 мкл плазмы или инактивированной сыворотки крови и вносят в лунки, куда затем добавляют по 30 мкл эмульсии кардиолипинового антигена. В каждую лунку вносят плазму или сыворотку крови от одного обследуемого и нумеруют соответственно списку в регистрационном журнале. Ингредиенты перемешивают встряхиванием пластины во встряхивателе (100 качаний в 1 минуту) в течение 5 минут, затем в каждую лунку добавляют по 90 мкл изотонического раствора натрия хлорида, перемешивают покачиванием пластины и оставляют при комнатной температуре на 5 минут (оптимальный температурный режим реакции 23-28 град.). Результаты учитывают только после появления хлопьев в контрольной слабоположительной сыворотке крови.

При использовании количественной методики постановки микрореакции в 9 лунок горизонтального ряда пластины, начиная со второй лунки, вносят по 90 мкл изотонического раствора натрия хлорида и добавляют в первую и вторую лунки по 90 мкл исследуемой плазмы или сыворотки крови. Содержимое второй лунки перемешивают автоматической пипеткой, забирая его и выпуская из нее в лунку 5-6 раз, затем забирают 90 мкл и переносят в третью лунку. Из третьей лунки 90 мкл переносят в четвертую и т. д. по десятую лунку, из которой 90 мкл удаляют. Таким образом получают двукратные разведения плазмы или сыворотки крови 1:2, 1:4, 1:8 и далее до 1:516. В первую лунку изотонический раствор натрия хлорида не приливают, а вносят только 90 мкл плазмы или сыворотки крови, т.е. исследуют цельную плазму или сыворотку крови. Во все лунки добавляют по 30 мкл эмульсии кардиолипинового антигена. Пластину встряхивают 5 минут, после чего во все лунки добавляют по 90 мкл изотонического раствора натрия хлорида. Через 5 минут регистрируют результаты так же, как при постановке качественной реакции.

Титром преципитинов считают последнее разведение плазмы или сыворотки крови, где обнаружен преципитат. Величина титра указывает на активность процесса, а его снижение во время лечения — на эффективность терапии. Стабильность титров настораживает клиницистов в отношении эффективности терапии, увеличение же их требует пересмотра лечения.

Для получения достоверных результатов следует пользоваться одной и той же серией препарата при обследовании больного в процессе лечения, что относится ко всем реакциям на сифилис.

К моменту снятия леченного больного с учета неспецифические тесты с кардиолипиновым антигеном обычно негативируются, в то время как позитивность специфических реакций может наблюдаться долго после окончания лечения, в связи с чем эти тесты не могут служить критерием излеченности и больные снимаются с учета с положительными результатами РИТ, РИФ, ИФА, РПГА.

Источники ошибок при постановке МР:

— неправильное взятие крови из пальца (наличие пузырей воздуха в капилляре пипеток);

— исключение из постановки реакции контрольных сывороток крови, в частности, слабоположительных;

— неравномерная концентрация антигена в эмульсии вследствие недостаточного перемешивания ее перед использованием;

— бактериальное загрязнение эмульсии;

— нарушение сроков и условий хранения плазмы и сыворотки крови, антигена и его эмульсии, растворов;

— замена трехзамещенного цитрата натрия двухзамещенным;

— использование при постановке реакций загрязненных пробирок, пипеток, пластинок, растворов.

Вышеуказанные ошибки могут приводить к появлению как ложноотрицательных, так и ложноположительных результатов реакции.